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作者:鄒倩、趙春杰、邱宏春 郭曉迪
摘要
目的 建立一種依匹哌唑原位凝膠植入劑的體外釋放方法,研究處方在體外的釋放行為和緩釋機制。
方法 以抗精神病依匹哌唑為模型藥物,制備以聚乳酸?羥基乙酸共聚物( polylactide gly? colic acid,PLGA)/醋酸異丁酸蔗糖酯( sucrose acetate isobutyrate,SAIB)為基質的原位凝膠植入劑。開發體外釋放檢測方法,采用多種體外釋放裝置研究依匹哌唑原位凝膠植入劑的釋放差異, 考察體外釋放的影響因素。
結果 依匹哌唑在酯基封端PLGA/SAIB處方下顯示出低突釋和釋放緩慢的特征,體外釋放以擴散為主,符合0級釋放模型。采用分層加樣的流通池法,藥物在14d可達到完全釋放,釋放率達(85. 4 ± 2. 4)% 。
結論 依匹哌唑原位凝膠植入劑適合采用流通池法進行體外評價,建立的體外釋放方法操作簡便、可靠。同時處方在體外表現出明顯的緩釋效果,且釋放穩定。
關 鍵 詞
一、簡 介
精神分裂癥和重度抑郁癥(major depressive disorder,MDD)是常見的嚴重精神類疾病,全球患病率約為1%。依匹哌唑(brexpiprazole)是第二代抗精神分裂癥藥物,用于成人精神分裂癥與MDD的輔助治療,主要作用機制是部分阻斷多巴胺D2受體和5?羥色胺受體(5?HT1A),拮抗5?HT2A和去腎上腺素能α1/2受體。FDA于2015年7月批準依匹哌唑片(商品名:Rexulti?)上市,每日口服一次。通常精神類疾病需要長期治療,目前已上市的抗精神病長效注射劑最長可實現6個月注射一次,在臨床上受到了患者和醫生的廣泛青睞,依匹哌唑目前暫無長效注射劑上市。國內外針對依匹哌唑開發的長效制劑技術包括混懸液、原位相變凝膠注射劑 、磷脂原位凝膠和微球,開發持續緩釋的依匹哌唑長效制劑將具有廣闊的應用和商業價值。原位凝膠植入劑(in situ gel forming implant,ISGFI)是將可生物降解的載體材料溶解于具有生物相容性的溶劑中,并與藥物混合,形成溶液或混懸液的一種新型緩釋注射劑。在注入肌肉或皮下后,處方在注射部位發生相轉變,形成由藥物和可生物降解材料組成的固體植入體,持續釋放藥物可達數天或數月。其中原位沉淀系統(聚合物沉淀和蔗糖酯沉淀系統)由于其具有輔料少、處方工藝簡單的優點而備受醫藥行業的青睞。本文作者擬制備依匹哌唑的原位沉淀系統制劑,在前期研究中發現醋酸異丁酸蔗糖酯( sucrose acetate isobutyrate, SAIB)/N?甲基吡咯烷酮(1?methyl?2?pyrrolidi? none,NMP)基質處方在體外固化形成的貯庫膠 凝強度較弱,體內和體外均表現出較高的突釋,突釋(24h)是原位凝膠制劑面臨的主要風險,短時間血藥濃度的升高,可能造成局部或全身的毒性反應。而處方中加入適當聚乳酸?羥基乙酸共聚物( polylactide glycolic acid,PLGA)后可有效降低體外突釋且SAIB與低分子量PLGA相容性良好,有研究報道,采用PLGA/SAIB作為基質用于原位凝膠植入劑的開發。
體外釋放方法是制劑質量控制的重要指標,可用于預測和評價產品在體內釋放,減少體內(人體和動物)實驗次數,大大降低藥物研發的成本。由于原位凝膠注射劑缺乏成熟的體內體外相關性模型,體外釋放方法的開發受限。主要存在的困難有:無標準化方法指導;膠凝形成植入物的形狀差異;體外無法完全釋放(>80% );釋放方法操作時間過長等。這些困難使得原位凝膠制劑的開發和仿制藥研發面臨巨大挑戰。本文作者以依匹哌唑為模型藥物,制備PLGA/SAIB為載體材料的原位凝膠植入劑,首先采用多種非胃腸道制劑常用的體外釋放方法 (透析法、槳法、搖瓶法、流通池法),從方法可操作性和釋放差異來評估其適用性。其次,制備不同PLGA型號(L/G比,封端)、不同溶劑的處方,考察制劑的影響因素和釋放機制,為進一步的體內研究提供數據支持。
二、儀器與材料
XS105DU型電子分析天平(瑞士 Mettler To? ledo公司),Agilent 1260高效液相色譜儀(配有DAD檢測器,美國Agilent公司),全自動流通池法溶出度測試系統(推薦使用華溶儀器DS-7CP PLUS 流池法溶出系統),溶出自動取樣系統(推薦使用華溶儀器DS-1406AT全自動取樣溶出系統),Nanopure純水儀( 美 國 Thermo Fisher Scientific公司)。
依匹哌唑原料藥(含量質量分數100.2% ,浙江華海藥業股份有限公司),N?甲基吡咯烷酮(1? methyl?2?pyrrolidinone,NMP,上海阿拉丁試劑有限公司),PLGA(德國贏創 EVONIK 公司,50∶ 50羧基封端PLGA502H:分子量分布7~17kDa;50∶ 50 酯 基封端 PLGA502:分子量分布7~17kDa;75∶25羧基封端PLGA752H:分子量分布4~15kDa),乙酸異丁酸蔗糖酯(sucrose acetateisobutyrate,SAIB,美國Eastman公司),三醋酸甘油酯(triacetin,TA,美國J. T Baker 公司),苯甲酸芐酯(benzyl benzoate,BB,上海阿拉丁試劑有限公司),苯甲醇(benzyl alcohol,BA,德國 Merck 公司),十六烷基三甲基溴化銨( cetyl ammoniumbromide,CTAB,上海阿達瑪斯試劑有限公司),十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS,美國Sigma 公司),聚乙二醇辛基苯基醚( Triton X? 100,上海滬試實驗室器材股份有限公司),氯化鎂(上海阿達瑪斯試劑有限公司),氯化鈉(上海滬試實驗室器材股份有限公司),氯化鉀、氯化鈣、二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、葡萄糖、碳酸氫鈉(上海泰坦科技股份有限公司),硫酸鎂、磷酸、乙腈、甲醇(美國Sigma公司)。
三、方法與結果
3.1 處方制備
3.1.1 釋放方法篩選
制備質量比為50∶ 50的SAIB?NMP基質,在振蕩儀上室溫振搖過夜,使其完全溶解,形成澄清透明均一的溶液。稱量上述溶液和質量比10%的PLGA502H于西林瓶中,磁力攪拌約30min使其完全溶解,再加入處方量的依匹哌唑原料藥(載藥量:10mg·g -1),攪拌至完全混勻,置于2~8 ℃備用。
3.1.2 處方釋放的影響因素考察
稱取處方量的SAIB,加入NMP或DMSO作為溶劑,放置于振蕩器上室溫過夜振搖使其完全混勻,形成澄清透明均一的溶液。按表1,稱量SAIB?溶劑基質、PLGA(不同封端和不同L/G比)和0、10% 、20% 釋放調節劑(三醋酸甘油酯和 苯甲酸芐酯)于西林瓶中,用磁力攪拌約30min使其完全溶解,再加入處方量的依匹哌唑原料藥(載藥量:10mg·g),攪拌至完全混勻,置于2~8 ℃備用。
表1 原位凝膠植入劑處方
表2 吡羅昔康凝膠IVRT的CAA
3.2 體外釋放檢測方法的建立
3.2.1 色譜條件
色譜柱:Agilent Eclipse Plus(100mm×4. 6mm,3. 5μm)柱,流動相:pH6.8磷酸鹽緩沖液(2. 8g磷酸氫二鈉至1L超純水,溶解混勻,用磷酸調節pH至6. 8,混勻,經0. 45μm微孔濾膜過濾)?乙腈(體積比45∶55),流速:1. 0mL·min,柱溫:35℃,檢測波長:215nm,進樣體積:20μL,運行時間:6min。
3.2.2 溶媒
稱量氯化鈉8g、 氯化鉀400mg、氯化鈣140mg、七水合硫酸鎂100mg、六水合氯化鎂100mg、二水合磷酸氫二鈉60mg、磷酸二氫鉀60mg、葡萄糖1g、碳酸氫鈉350mg和十六烷基三 甲基溴化銨1g于1L純化水中,攪拌至完全溶解。
3.2.3 對照品溶液
稱取適量依匹哌唑原料藥,置于500mL量瓶中,用乙腈?水(體積比75∶25)超聲溶解,定容,制成60μg·mL的依匹哌唑對照貯備液;移取適量對照品貯備液,用溶媒作為稀釋液,稀釋定容制成6μg·mL的對照品溶液。
3.2.4 方法學驗證
空白溶媒、空白輔料(PLGA/SAIB/NMP 混 合基質)和樣品溶液色譜圖見圖1,在依匹哌唑(保留時間約4. 0min)出峰處無明顯干擾,方法專屬性良好。以依匹哌唑峰面積(A)為縱坐標,樣品質量濃度( ρ,μg·mL)為橫坐標進行線性 回歸,所得標準曲線方程為A=196. 6ρ+2. 001,r=1.000,線性范圍為0. 3~12μg·mL,線性關系良好。準確度研究:0. 3、6、9μg·mL三個質量濃度水平的測得濃度和理論濃度比值分別為101. 4% 、100.5%和100.3%(n=3),RSD為2.8%(n=9),表明準確度良好,方法學驗證結果均符合接受標準。
圖1 空白溶媒(A)、空白輔料溶液(B)和樣品溶液(C)的高效液相色譜圖
3.3 釋放介質的選擇
參考上市產品Perseris? ,Hank′s平衡鹽溶液可以模擬人體皮下環境間質液的pH和離子組成。由于依匹哌唑原料藥在Hank′s平衡鹽溶液 中的飽和溶解度小于0.1μg·mL,為滿足漏槽條件,考察了加入質量分數分別為0. 1% 、0.2%、0. 5%和1. 0%的不同種類表面活性劑的飽和溶解度(37 ℃ ),結果見表2,其中CTAB的增溶效果最明顯。當介質中加入質量分數0. 1%CTAB(臨界膠束濃度:0.033%~0.036%,來自USP)時,可滿足漏槽條件,同時,CTAB具有一定的抑菌性,可防止長期運行而產生的微生物污染。最終選擇溶媒為Hank′s平衡鹽溶 液+0. 1%CTAB。另外,考察了依匹哌唑在37 ℃條件下的溶液穩定性,結果表明依匹哌唑原料藥在溶媒中21d內穩定,回收率均在98. 0%~102.0% ,滿足制劑長期釋放要求。
表2 37 ℃下依匹哌唑在pH7. 4Hank′s平衡鹽+不同表面活性劑中的飽和溶解度(n=3)
3.4 體外釋放方法考察
原位凝膠植入劑常用體外釋放方法有搖瓶法、透析法(正相、反相透析,綜合透析法)、槳法(USP2 法)、流通池法(USP 4 法)等。由于原位凝膠植入劑的釋放表面積的不同可能影響藥物的釋放,所以在前期研究中,采用綜合透析法(D? Tube TM Dialyzer Mini,截留分子量為12~14 kDa透析管+籃法)進行釋放研究,將處方加入透析管中,再將透析管放入籃法中,把處方釋放表面積控制在透析管膜上,結果發現處方釋放非常緩慢(2d釋放不到10% )且重復性差。推斷的原因是透析膜對藥物的擴散有阻礙,釋放受到膜的限制;其次處方中含有SAIB,由于SAIB黏度較大,易黏附在透析膜上,阻擋管內外的介質交換,導致釋放延遲,所以不適宜采用透析法。
3.4.1 搖瓶法
用1mL帶21G針頭注射器吸取0.1mL制劑處方,注入60mL溶媒,轉速:75r·min-1,搖床溫度:37 ℃,于設定的時間點取樣2mL,經0. 45μmPVDF過濾后進行檢測。
3.4.3 槳法
用1mL帶21G針頭注射器吸取0.1mL制劑處方,用注射器將處方從液面下打入900mL溶出杯中。轉速:50r·min,溫度:37 ℃,于設定時間 點取樣2mL,經10μm在線過濾頭和0.45μm PVDF濾膜過濾后測定,使用防揮發罩,注意溶媒揮發。
3.4.3 流通池法
閉環,流速:8mL·min,溶媒溫度:37℃,溶酶體積:900mL,于設定時間點取樣2mL,經2.7μm直徑玻璃纖維過濾膜(GF/D,What? manTM )和0.45μmPVDF過濾。加樣方式A:向22.6mm制劑池底部加入1顆紅寶石球,用直徑1mm玻璃珠填充至樣品池底部錐形部分,加入8mL溶媒,在液面下用1mL注射器(21G針頭)注入0.1mL樣品,鋪在玻璃珠上層,待膠凝10min后開始運行。加樣方式B(分層加樣?上下 加玻璃珠):加樣方式與前面步驟一致,在膠凝10min后在原位制劑上方再加入約9g玻璃珠后,運行程序。
3.4.4 統計分析
每批處方至少制備三份,計算不同時間點的平均累積釋放率,為了對比同一時間點兩個值之間差異的顯著性,使用置信水平為95%的t檢驗,P<0.05被認為是具有顯著性差異。采用Graph? Pad Prism7軟件進行統計分析。
3.4.5 體外釋放方法比對
在SAIB?NMP= 50∶ 50(質量比)基質中加入 質量比為10%PLGA502H,考察三種常用體外釋 放方法(搖瓶法、槳法和流通池法?加樣方式A)的 釋放差異。結果見圖 2。
圖2 不同釋放方法體外釋放曲線比對(x ± s,n = 3)
從圖可知,三種方法的釋放速度具有一定差異,槳法、流通池和搖瓶法7d累積釋放率分別為(73. 01 ± 3. 78)% 、(61. 79 ± 8. 34)% 和(50. 86 ± 4. 48)% 。為研究處方的釋藥機制,對三種體外釋放結果使用Origin Pro 8.0軟件分別進行體外釋放動力學模型擬合,包括:0級動力學方程、1級動力學方程、Higuchi方程,詳見表3。
表 3 不同釋放方法的體外釋放擬合方程結果
從擬合方程結果可以看出,搖瓶法結果符合1級釋放模型,槳法和流通池法符合Higuchi方程。Higuchi方程為骨架擴散機制,是描述藥物從基質釋放的常用數學模型。以PLGA/SAIB/NMP基質的處方加入介質后,在發生相轉變過程中藥物隨溶劑NMP擴散到介質中為突釋階段;1136沈陽藥科大學學報第40卷然后PLGA遇水固化后形成被薄膜包圍的多孔結構,當制劑表面或表層的藥物釋放完成后,深層的藥物通過彎曲的孔道擴散出來;最后藥物隨聚合物溶蝕而釋放,整個釋藥過程以擴散為主。Higuchi方程更符合該處方的體外釋藥特性。另外,搖瓶法在取樣時發現凝膠制劑易受到破壞,導致制劑損失和結果重復性差。同時,原位凝膠植入劑釋放時間較長(如14、30d 等),槳法裝置下溶媒揮發,操作時間過長,可能導致釋放結果的不準確且無法自動化取樣的搖瓶法裝置,會增加工作量。因此,本文作者采用流通池法對處方釋放 影響因素的考察。
3. 5 依匹哌唑原位凝膠植入劑體外釋放影響因素考察
3.5.1 不同PLGA類型對釋放的影響
不同封端基團由于聚合物極性差異會表現出不同的釋放行為 ,考察加入不同封端的PLGA(PLGA502H 和 PLGA502)和不同L/G 比例PL? GA(75∶25,PLGA752H)處方的釋放差異(圖3)。
圖3 不同PLGA類型對體外釋放的影響(流通池法?加 樣方式A,x ± s,n=3)
根據圖3可以看出,不同PLGA型號?SAIB的混合基質處方體外釋放差異較大。首先是突釋,PLGA752H處方1d內的體外突釋為(28. 3 ± 4. 4)% , 與 PLGA502[( 4. 4 ± 1. 6 )% ]和PL? GA502H[(6. 5 ± 1. 2 )% ]相比,具有明顯差異 (P<0. 05),而不同封端PLGA的處方突釋無明 顯差異。從第5天起,以羧基封端處方釋放明顯 快于酯基封端,14d釋放分別約(80. 6 ± 4. 9)%和(32. 7 ± 4. 8)% 。PLGA 502以酯基封端,極性 較低,親水性弱,依匹哌唑為BCS II類的親酯性 藥物,與聚合物的親和力較溶劑更強,體外釋放緩 慢,比羧基封端表現出更長的緩釋效果。另外,通 過與0級、1級和Higuchi釋放模型方程的擬合,PLGA502H( r2 = 0. 9921)和PLGA502( r 2=0. 9754)的處方均表現出0級釋放特征。而在PLGA752H處方下,整體釋放速率較其他兩種更快,釋放擬合模型符合Higuchi方 程(r2 = 0. 9753)。因此,優先選擇酯基封端的PLGA502繼續進行考察。
3.5.2不同溶劑和釋放調節劑對釋放的影響
溶劑移除原位制劑系統中常用的有機溶劑主要分為與水混溶和與水部分混溶兩種類型 。與水 互溶的溶劑容易形成均勻的凝膠貯庫,利于注射,并且在皮下組織幾分鐘快速進行相轉變。而疏水性溶 劑會在數周或數月進行相轉變,被稱為緩慢相轉變,對應的制劑系統黏度較高,形成的貯庫是均勻致密 有限的小孔,突釋低 。本文作者選擇向PL? GA502/SAIB基質中加入不同溶劑和釋放調節劑, 對比不同溶劑和混合溶劑的釋放差異(圖4)。
圖 4 不同溶劑對體外釋放的影響(x ± s,n = 3)
從圖4可以看出,PLGA502/SAIB基質中加入NMP或DMSO,整體釋放速率接近。采用DMSO作溶劑時,結果重復性較差,故優選 NMP為溶劑。向NMP中加入不同含量的疏水性溶劑(TA 和 BB)的釋放曲線見圖5,結果見表4,處方中分別加入質量分數為10%和20%BB后,24h突釋率增長至(28. 1 ± 4. 9)% 和(22. 4 ± 6. 3)% ;加入10%TA 后,突釋率增長至(21. 1 ± 8. 5)% 。24h突釋率和平均釋放率相比未添加疏水性溶劑具有顯著性差異(P<0. 05)。這種現象也有類似的報道,可能的原因是依匹哌唑原料藥在疏水 性 溶 劑BB( 4. 6 mg · mL-1,25 ℃ )和TA(2. 1mg·mL-1,25 ℃)中的溶解度較低,依匹哌唑原料藥在處方中呈現懸浮狀態,在注入介質后,未被基 質包裹的依匹哌唑原料藥會快速隨溶劑擴散出去,第9期鄒倩等:依匹哌唑原位凝膠植入劑的體外釋放研究 1137導致突釋的增加。所以從降低體外突釋的目標來說,處方選擇不加入釋放調節劑 BB和TA。
圖 5 NMP/ 不同添加劑對釋放的影響 (x ± s,n = 3)
表 4 不同添加劑對釋放的影響
3.5.3 釋放機制研究
由于體內環境和植入物形成微觀結構變化機制的復雜性,體外往往很難去模擬制劑在體內的 釋放過程。其中關鍵影響因素之一就是制劑在注 射部位形成植入物的尺寸和形狀。Patel等使用掃描電子顯微鏡觀察到PLGA/NMP基質在體外環境下,注射7d 后植入物呈現均勻的球形;在皮下注射后,移除時呈現平坦的圓盤狀。這是由 于藥物注射后受到皮下周圍組織的壓縮,成型后的植入物產生形變,產生更大的表面積。另外,與體內形成的植入物相比,在體外直接注射形成的植入物會經歷更多的膨脹,但在體內周圍組織的 間隙壓力阻礙了植入物的擴張,迫使藥物和溶劑機械性釋放。所以原位凝膠制劑在體內通常會展 現出比體外更高的釋放。為更好地表征處方的釋放過程,降低體內風 險,闡明釋放機制,本研究通過分層加樣的方式(B)模擬制劑體內的擠壓狀態進行體外評價,加樣裝置(A和B)見圖 6。在下方加入玻璃珠可以 使溶媒流動形成層流,在上方加入玻璃珠可以將 樣品固定,同時形成擠壓,模擬制劑在體內的擠壓狀態。已有類似改良加樣方式的研究,Forrest 等采用分層加樣的方式對納米混懸液制劑進 行體外釋放,可得到明顯不同的三相釋放結果。對PLGA502/NMP/SAIB 處方采用常用加樣方式(A)與分層加樣方式(B)分別進行研究。
圖 6 原位凝膠植入劑加入樣品池的示意圖
從圖7可看出,采用分層加樣方式(B)后,突釋為(6.2 ± 1.8)%,相比直接加樣方式的突釋率(4.6 ± 0.9)% ,無顯著差異。但從第5天開始,體外釋放明顯加快,14d可達(85. 4±2. 4)% ,達 到完全釋放( > 80% )。隨著介質的進入和溶劑 的擴散,聚合物載體逐漸膨脹,而玻璃珠的擠壓使 得基質內的藥物隨溶劑擴散出來,導致藥物釋放 速率加快,釋放過程以擴散為主。另外,對釋放結果分別用0級、1級和Higuchi方程進行擬合,擬 合結果見表5。處方在不同釋放方法條件下均表 現出0級釋放的特征。這是由于PLGA502疏水性較強,可減慢介質進入基質的時間,使得降解主要發生在制劑表面,將藥物的釋放限制在可降解區域,以近似恒定速率進行釋放。
圖 7 原位凝膠植入劑在不同加樣方式的流通池法下的 體外釋放曲線(x ± s,n = 3)
表 5 PLGA/SAIB/NMP基質處方體外釋放模型擬合
四、討 論
原位凝膠植入劑是一種新型長效注射劑,目前沒有標準化的藥典體外釋放方法。本文參考上市產品、文獻和藥典方法,考察了多種原位凝膠注 射劑常用的體外釋放方法。結果顯示,流通池可以更好地反映依匹哌唑原位凝膠植入劑的體外釋放行為并且具有良好的區分力。USP4法是目前認為最適用于緩釋非胃腸道劑型的裝置,閉環可模擬體內流體動力學變化且避免長時間釋放過程溶媒的揮發,已有多個微球制劑采用流通池法并建立了良好的體內體外相關性 。
其次,本文作者以降低依匹哌唑原位凝膠植入劑的體外突釋和釋放速率為目標,對制劑處方的關鍵質量參數(PLGA 封端、L/G比例、溶劑、釋放調節劑)進行了考察。在以NMP為溶劑時,酯基封端相較羧基封端的PLGA和PLGA752H結果相比,依匹哌唑原料藥在PLGA502中的親和力更強,表現出更好的緩釋效果。在處方中加入疏水性溶劑苯甲酸芐酯和三醋酸甘油酯后,藥物1d內的體外突釋反而增加。由于原位凝膠植入劑在體內的釋放過程十分復雜,釋放可能會受到皮下環境、宿主與植入物之間的相互作用還有藥物吸收的影響。本文作者則采用注射器吸取處方打入釋放介質中成型,模擬處方經注射后在注射部位膠凝過程。優化加樣方式,在成型后的植入物上方加入玻璃珠,模擬皮下擠壓狀態。改良加樣方式后的流通池法可以使制劑在14d達到完全釋放,有效縮短運行時間,不改變釋放機制。本裝置可作為評估原位凝膠植入劑在體內風險的方式,為進一步的體內研究奠定基礎和提供數據支持。