翻譯：華溶應用中心

審核：工業藥劑發燒友

摘要

流池法溶出儀是控釋劑型、難溶性藥物和許多特殊劑型(如混懸液、軟膠囊、植入劑、微球和脂質體)溶出度測試的首選儀器。雖然流池法溶出儀已列入藥典多年，但一直沒有正式的性能驗證試驗(PVT)方法。在這項研究中，水楊酸片被用來開發流池法的PVT。水楊酸片在籃法和槳法裝置上相同的溶蝕和零級釋放機制，可作為流池法裝置中PVT的潛在參考標準品。在第一階段，采用實驗設計法(DoE)系統考察了四個參數對水楊酸片溶出度的影響。片劑裝載方式是影響溶出度的最重要參數；流速和池體內徑(ID)也有顯著影響，溫度對溶出的影響可以忽略不計。在第二階段，由四名不同的分析人員在不同的流池法裝置上（即四名合作者）進行溶出試驗，以進行重復性和重現性評估，并確定PVT的初步可接收標準。第二階段的實驗條件是將片劑放置在帶有玻璃珠的片劑支架上，池體ID為12 mm，流速為16 mL/min，溫度為37℃，90分鐘采集樣品。第五個合作者的數據證實了PVT的可重復性。

關鍵詞

一、引言

流通池是一種使用流動的溶出介質通過裝有制劑的池體的溶出裝置（推薦使用華溶DS-7CP PLUS 流池法溶出系統）。流通池裝置由放置的介質貯液池、泵、水浴、流通池、過濾系統和樣品收集器組成。制劑與介質貯液池分離，便于在溶出試驗中調節介質體積或pH值。流通池裝置具有閉環和開環兩種結構。在閉環系統下，介質體積可以根據儲液容量進行很好的改變。該配置特別適用于低劑量藥物的溶出試驗，通過使用少量介質達到足夠的濃度。開環系統提供了無限的漏槽條件，這通常是控釋劑型和難溶性藥物的首選條件。在開環系統中，流通池可以在實驗過程中改變溶出介質，模擬體內環境相關的pH變化。這特別適用于pH敏感型藥物的溶出測試，如靶向劑型和靶向藥物釋放系統。配備各種類型的流通池，流池法裝置在新型和特殊劑型的溶出試驗中也顯示出很大的優勢，包括但不限于脂質體、納米顆粒、微球、粉末、顆粒、混懸液、軟膠囊、植入物、栓劑、油類制劑和凝膠。

從歷史上看，流池法溶出儀最早于20世紀60年代在美國應用于溶出度試驗，隨后被引入許多國家和國際組織。在中國，與流池法類似的設備于1985年首次列入中國藥典，但于1990年被撤回；2020年，流池法溶出儀被正式納入《中國藥典》。隨著流池法溶出儀在中國的普及，需要一個標準的性能驗證試驗（PVT）來保證溶出度試驗的質量。一般來說，需要機械校準和PVT來確定溶出裝置的適用性。PVT是一種評估整個程序的方法，包括儀器、分析程序和分析人員。PVT的開發涉及到幾個因素，例如在短時間內執行測試的便利性和準確性（即重復性、穩健性和重現性）。此外，參考標準藥物應該是穩定的，最好是無毒的產品，具有易于量化分析的特點。最后，PVT的結果應響應設備的關鍵操作參數的變化。Eaton及其同事報道了用于流池法PVT的早期開發，將水楊酸片作為候選參考標準片，其中研究了流速、溫度、玻璃珠的數量和大小、脫氣水平、片劑方向、儀器制造商和分析人員。然而，從政策的角度來看，世界上還沒有廣泛接受的機械檢驗準則和PVT標準。

目前的研究范圍是開發用于流池法裝置的PVT，其中將評估影響溶出的主要變量并確定PVT的初步接受標準。水楊酸片劑具有不崩解、無毒、性能穩定性好等特點，有望成為理想的試驗藥物，Eaton等人已成功將其用于PVT的開發。更重要的是，目前中國的籃法、槳法和小杯法PVT均采用水楊酸片，保證了片劑的質量，也為未來的流池法的PVT提供了良好的依從性。

研究分為兩個階段：第一階段采用實驗設計(DoE)方法，系統考察各參數對水楊酸溶出度的影響，一個有力統計工具，用于確定過程中各因素和響應之間的相關性。在第二階段，參考美國藥典（USP）1法和2法的PVT分析方法，將由不同的分析人員在不同儀器上進行重復性和重現性評估，獲得并應用流動池（4法）PVT的初步驗收標準。

二、方法

2.1 材料

使用的材料和試劑如下：水楊酸標準品（99.8%，批號100106202106，中國食品藥品監檢定研究院），水楊酸標準片（見表1，批號100103-202114，中國食品藥品監檢定研究院），磷酸二氫鉀（99.5%，批號68887172，中國邁瑞爾），氫氧化鈉（98%，批號78687053，中國邁瑞爾），超純水（電阻率18.2 MΩ·cm, 25°C），玻璃纖維過濾膜GF/F（直徑25mm，批號9817071，GE醫療生命科學Whatman，中國制造）。對片劑的理化性質進行了評估，結果見表1。

表1. 水楊酸片的理化特性

2.2 溶出介質和標準溶液

稱取47.6克磷酸二氫鉀和11.06克氫氧化鈉溶于7升超純水中。調節溶液的pH值在7.4±0.05范圍內. 用磁力攪拌器攪拌加熱至45℃，用真空泵脫氣5分鐘（壓力低于100毫巴）。

制備水楊酸對照品儲備液，稱取20mg的水楊酸標準品至250ml容量瓶中。用約1ml乙醇溶解水楊酸粉末，用溶出介質定容至250ml。

 制備水楊酸對照品溶液，移取10 mL儲備液液至50 mL容量瓶中，溶出介質定容至50ml。

2.3 溶出度試驗第一階段：影響溶出度的變量研究

第一階段的目標是：

1）研究主要變量對溶出度結果的潛在影響；

2）為第二階段的重現性和重復性評估確定合適的實驗條件。

通過初步實驗(數據未顯示)，初步確定了4個參數作為自變量：池體內徑(ID)、流速、溫度、裝片方式。其他變量包括介質成分、體積、脫氣方法、流通池的配置、玻璃珠加入量和泵脈沖，在本研究中未進行調查。

采用DoE方法系統地研究了四個選定變量在溶出度檢測中的貢獻。采用JMP 13軟件（SAS Institute Inc.， USA）進行DoE和數據分析（殘差最大似然[REML]法）。以水楊酸的溶出度為因變量，進行定制設計。對于四個自變量，將池體ID設置為兩個水平（12和22.6 mm）的分類變量；流速設為離散變量，分別為8、16、32 mL/min三個水平；溫度設為連續變量，分別為3個水平（35、37、39℃），裝片方式設為分類變量，分別為4個水平（片劑在片劑架上且錐體處含玻璃珠[HWB]、片劑在片劑架上錐體處無玻璃珠[HWOB]、片劑在玻璃珠床層頂部[T]、片劑內埋在玻璃珠中[E]）。考慮到參數調整的難度，將裝片模式設置為簡單，而其他的設置都是困難的。個體變量的主要效應和二次交互效應分析了各變量組合與因變量的相關性。DoE矩陣由33個試驗組成，分布在11個區塊（補充材料，表S1）。每次試驗均參照該矩陣設置合適的儀器參數。

溶出測試在Sotax CE 7smart系統（固件2.40）上進行，該系統與CP7-35活塞泵和C615組分收集器（Sotax AG，瑞士）相結合。在測試之前，將泵的流量驗證到規定值（基于初步實驗使用的流量）。所有七個通道的流量最大偏差應小于2%，以滿足驗證標準。

圖1：片劑在片劑架上且錐體處含玻璃珠[HWB]、片劑在片劑架上錐體處無玻璃珠[HWOB]、片劑在玻璃珠床層頂部[T]、片劑內埋在玻璃珠中[E]

圖1展示了四種片劑裝載方式。對于HWB模式，詳細操作如下。將一顆紅寶石和一勺玻璃珠（直徑1mm）依次放入池體中，然后將一片藥片放在藥片支架上，然后將GF/F過濾膜組裝在池體頂部。HWOB模式與HWB相同，只是沒有玻璃珠。T模式也很像HWB，除了把片劑放在玻璃珠床層上而不是放在片劑支架上。對于E模式，首先將藥片放在一勺玻璃珠床層頂部，然后在池體的剩余空間中填充玻璃珠。溶出試驗的其他參數保持相同，包括7個通道，每個通道900 mL溶出介質，閉環配置，泵脈沖120 r/min，在10、30、60、90和120分鐘收集2.5 mL樣品溶液。

2.4 溶出度試驗第二階段：重復性和再現性評估

第二階段的目的是：1）評價水楊酸片作為流池法PVT標準片的可行性；2）考察溶出度試驗的重復性和重現性；3）確定PVT的初步驗收標準。溶出試驗在兩個試驗裝置中進行。在第二階段測試中四名分析人員和五個組件（Sotax CE 7智能系統，制造年份從2013年到2021年不等）。一個分析人員和一個組裝人員的組合被稱為合作者。通過這種方式，來自同一合作者的數據由同一程序集中的同一分析人員獲得。總共有五個合作者。來自四位合作者的數據被用來確定PVT的初步接受標準，第五位合作者根據該接受標準進行PVT。所有實驗在相同的條件下進行，如第一階段所確定的：12 mm池體ID，16 mL/min流速，37℃， HWB片劑裝載模式，7通道，每通道900 mL介質，閉環配置，泵脈沖120 r/min，在10、30、60、90和120分鐘收集2.5 mL樣品溶液。

在本研究中，建立了流池法裝置PVT的單階和兩階試驗的初步可接受范圍。分析方法與USP 1法和2法的PVT相似。評估了三個方差成分：合作者間、實驗間和殘差（實驗內）。繪制水楊酸片劑溶出百分數的總體分布規律（補充資料，圖S1）。數據分布尾部不均勻，與1法和2法的結果相似。因此，采用自然對數尺度來改善溶出度值分布（轉換為正態分布）的對稱性。

對于單階試驗，初步接受限由溶解百分比值（對數值）的平均值±t SD確定，其中t為95%置信度系數，SD為可重復性標準差。以7通道裝配（Sotax CE 7smart系統）為例，將測試兩組7片（共14片），初步驗收限值為：

在Eq. 1中，exp代表指數，其中均值和方差(S2)通過重復性和重現性評估估計。下標C、E和R分別表示合作者間、實驗間和剩余方差成分。在本研究中，t = 2.776，在均值的SD中有4個自由度。對于對數尺度的實驗內方差，其上限為F× ，其中F1為F分布的5%上限。在本研究中，F = 1.933，七通道的分子自由度為12，實驗內分母自由度為55。原始百分比溶出度的變異系數（%CV）用對數正態公式對自然對數標度的方差進行變換得到的：

采用單階試驗，需進行2次試驗，14片（7片/次× 2次）的數據根據單階試驗的初步驗收限度進行評價。

對于雙階實驗，有兩個初步驗收限制，每個階段一個。階段1的評估類似于單級檢驗，使用80%的置信度而不是95%的置信度，這將縮小區間。第一階段測試更嚴格的初步驗收限制將確保評估PVT中首次運行數據的統計能力。在雙階實驗的第二階段，確定初步驗收限制以保持單階段測試通過的概率(95%置信度)。因此，將第1階段和第2階段獲得的數據結合起來進行評估，得到第2階段的初步驗收限度，其值應與單階試驗的值相同。

2.5 檢測

采用紫外-可見光譜法測定介質中水楊酸的濃度，使用兩臺紫外-可見光譜儀:UV/VIS Excellence UV7 （Mettler-Toledo GmbH，瑞士），軟件版本為3.0.1；Cary 3500 UV-VIS Engine （Agilent Technologies，馬來西亞制造），軟件版本為Cary UV Workstation版本1.1.298。每個樣品（2.5 mL）用空白溶液稀釋5倍至12.5 mL，使用石英比色皿（10mm光程）在296 nm處測定吸光度。

三、討論與結果

以水楊酸片為標準片的可行性分析

水楊酸片的溶出機制為不崩解和溶蝕，用籃槳法溶出儀進行溶出試驗證實了這一點。在本研究中，收集了5個時間點（10、30、60、90和120 min）的組分，并采用分光光度法測定其API濃度。以時間為自變量，對溶出度數據進行線性回歸分析。所有33項試驗均達到極好的線性；31個試驗的相關系數為0.9911-0.9999，另外2個試驗的相關系數為0.9742和0.9878。說明水楊酸片在流池法裝置中的溶出過程為零級釋放機制，與在籃法和槳法裝置中的一致。盡管在不同條件下進行了33次試驗，但該機制不受流經池體參數調整的影響。因此，水楊酸片具有足夠穩定的理化性質，可作為流池法溶出儀中PVT的參考標準片。

通過計算RSD分析33個試驗溶出度數據的波動。對于五個時間點，RSD結果令人滿意，中位數和第三四分位數RSD值分別為2.7%和4.9%。僅觀察到少數高RSD值，這可能是由于第一階段篩選參數未優化以及平行實驗數量較少（n = 2）造成的。但90 min時RSD值均小于10%，相對穩定。考慮到PVT方法的效率，選擇90 min作為后續分析的關鍵時間點。這些數據見補充資料(表S2-S4)。

表2. 個體變量的初始效應和二次交互效應

表2顯示了四個單獨參數的影響及其相互作用。三個參數及其配對相互作用表現出顯著差異(p < 0.01)。片劑裝載方式是影響溶出度的最重要參數。流速和池體ID也有顯著影響。然而，溫度對溶解的影響可以忽略不計。

圖3. 用數學模型預測了四個參數對水楊酸片溶出度的影響。片劑裝載方式HWB為片劑在片劑架上且錐體處含玻璃珠、HWOB為片劑在片劑架上錐體處無玻璃珠、T為片劑在玻璃珠床層頂部、E為片劑內埋在玻璃珠中[E]

圖3顯示了這四個參數的詳細趨勢。E型溶出度最高，T型溶出度居中，HWB型和HWOB型溶出度最低（相近），流速與溶出值成正比關系。對于池體ID，12mm的溶出值始終高于22.6 mm。這三種趨勢可歸因于水楊酸在流池法裝置中的零級釋放機制。在不崩解的情況下，水楊酸片的溶蝕速度與體積流速成正比。在相同流速下，內徑和截面積越小的池體線速度越高，對片劑的侵蝕效應越大。同樣，充滿玻璃珠的空間有更小的橫截面積可供流動通過，這導致了更高的線速度。在E型和T型模式中，放置片劑的空間分別全部和部分填充了玻璃珠。對于HWB和HWOB模式（分別有或沒有玻璃珠），放置藥片的空間沒有填充任何玻璃珠。因此，線速度依次為E、T、HWB/ HWOB，與其溶出速度變化趨勢相同。

在第二階段，我們選擇了一個具有適當的溶出值和較小的實驗內方差的實驗條件進行重復性和重現性評估，以確定流池法裝置PVT的初步驗收標準。與其他裝模式相比，HWB模式的實驗內方差（數據未顯示）最小。為了保持流池法裝置的溶出值與籃法和槳法裝置的溶出值相當，選擇了12 mm ID池體和16 mL/ min流速的組合。因此，確定第二階段實驗條件：以HWB型放置片劑，流速為16ml /min，流速為12mm，溫度為37℃，90分鐘取樣。該實驗條件未納入33項初步試驗，其性能根據JMP軟件建立的上述數學模型進行計算和預測。該條件下的溶出度估算值為22.2%，與中國藥典中水楊酸PVT片的籃法 （21-26%）和槳法（20-26%）裝置的驗收標準相似。將該估計值與實驗測量值進行了比較，驗證了數學模型的擬合性。

對于重復性和重現性評估，表3列出了對應于Eq. 1中參數的溶出度的平均值和方差。流池法的PVT的初步驗收標準由式1計算，見表4，包括單階和雙階測試。數學模型的預測值為22.2%，在初步可接受標準范圍內。預測值22.2%與實驗平均值24.5%的絕對誤差僅為2.3%，表明DoE生成的數學模型是指導和預測實驗的有力工具。

第五個合作者的數據證實了成功的重復性。第一次試驗的平均溶出值和%CV分別為23.8%和1.5%。這些數據滿足初步驗收標準（表4），因此不需要進行第二次實驗。

表3. 重復性和再現性評估中的溶解值和方差

表4. 流池法（7通道）PVT初步驗收標準

未來的合作研究應該有更大的覆蓋范圍，包括來自監管機構、制藥公司、CRO和儀器制造商的實驗室。考慮到差異，ISO指南21748規定了參與協作研究的實驗室的最少數量為15個自由度。

四、結論

在本次雙階實驗研究中，水楊酸片被用于開發流池法裝置的PVT，它遵循與籃法和槳法裝置相同的溶蝕和零級釋放機制。因此，水楊酸片可作為流池法溶出儀PVT的潛在標準參比片。本研究第一階段發現，影響溶出度的最重要因素是片劑的裝載方式，其次是流速和細胞內徑；然而，溫度沒有顯著的影響。第2階段通過以下實驗條件（基于第1階段實驗）確定了流池法PVT的初步驗收標準：將片劑放置在帶有玻璃珠的片劑架上，池體ID為12 mm，流速為16 mL/min， 37℃下90分鐘。重復性和重現性評估由不同的分析人員在兩個測試設施的不同設備上進行了確認。本研究建立了一個流池法溶出裝置的初步的可接受限度溶出PVT。水楊酸片對流池法裝置操作參數的敏感性需要在較窄的范圍內和更多的合作者進行進一步的研究。

五、參考文獻

略

如需原文，請聯系小編（代老師15012941165）