翻譯：華溶應(yīng)用中心

審核：工業(yè)藥劑發(fā)燒友

摘要

流池法溶出儀是控釋劑型、難溶性藥物和許多特殊劑型(如混懸液、軟膠囊、植入劑、微球和脂質(zhì)體)溶出度測試的首選儀器。雖然流池法溶出儀已列入藥典多年，但一直沒有正式的性能驗證試驗(PVT)方法。在這項研究中，水楊酸片被用來開發(fā)流池法的PVT。水楊酸片在籃法和槳法裝置上相同的溶蝕和零級釋放機制，可作為流池法裝置中PVT的潛在參考標準品。在第一階段，采用實驗設(shè)計法(DoE)系統(tǒng)考察了四個參數(shù)對水楊酸片溶出度的影響。片劑裝載方式是影響溶出度的最重要參數(shù)；流速和池體內(nèi)徑(ID)也有顯著影響，溫度對溶出的影響可以忽略不計。在第二階段，由四名不同的分析人員在不同的流池法裝置上（即四名合作者）進行溶出試驗，以進行重復(fù)性和重現(xiàn)性評估，并確定PVT的初步可接收標準。第二階段的實驗條件是將片劑放置在帶有玻璃珠的片劑支架上，池體ID為12 mm，流速為16 mL/min，溫度為37℃，90分鐘采集樣品。第五個合作者的數(shù)據(jù)證實了PVT的可重復(fù)性。

關(guān)鍵詞

一、引言

流通池是一種使用流動的溶出介質(zhì)通過裝有制劑的池體的溶出裝置（推薦使用華溶DS-7CP PLUS 流池法溶出系統(tǒng)）。流通池裝置由放置的介質(zhì)貯液池、泵、水浴、流通池、過濾系統(tǒng)和樣品收集器組成。制劑與介質(zhì)貯液池分離，便于在溶出試驗中調(diào)節(jié)介質(zhì)體積或pH值。流通池裝置具有閉環(huán)和開環(huán)兩種結(jié)構(gòu)。在閉環(huán)系統(tǒng)下，介質(zhì)體積可以根據(jù)儲液容量進行很好的改變。該配置特別適用于低劑量藥物的溶出試驗，通過使用少量介質(zhì)達到足夠的濃度。開環(huán)系統(tǒng)提供了無限的漏槽條件，這通常是控釋劑型和難溶性藥物的首選條件。在開環(huán)系統(tǒng)中，流通池可以在實驗過程中改變?nèi)艹鼋橘|(zhì)，模擬體內(nèi)環(huán)境相關(guān)的pH變化。這特別適用于pH敏感型藥物的溶出測試，如靶向劑型和靶向藥物釋放系統(tǒng)。配備各種類型的流通池，流池法裝置在新型和特殊劑型的溶出試驗中也顯示出很大的優(yōu)勢，包括但不限于脂質(zhì)體、納米顆粒、微球、粉末、顆粒、混懸液、軟膠囊、植入物、栓劑、油類制劑和凝膠。

從歷史上看，流池法溶出儀最早于20世紀60年代在美國應(yīng)用于溶出度試驗，隨后被引入許多國家和國際組織。在中國，與流池法類似的設(shè)備于1985年首次列入中國藥典，但于1990年被撤回；2020年，流池法溶出儀被正式納入《中國藥典》。隨著流池法溶出儀在中國的普及，需要一個標準的性能驗證試驗（PVT）來保證溶出度試驗的質(zhì)量。一般來說，需要機械校準和PVT來確定溶出裝置的適用性。PVT是一種評估整個程序的方法，包括儀器、分析程序和分析人員。PVT的開發(fā)涉及到幾個因素，例如在短時間內(nèi)執(zhí)行測試的便利性和準確性（即重復(fù)性、穩(wěn)健性和重現(xiàn)性）。此外，參考標準藥物應(yīng)該是穩(wěn)定的，最好是無毒的產(chǎn)品，具有易于量化分析的特點。最后，PVT的結(jié)果應(yīng)響應(yīng)設(shè)備的關(guān)鍵操作參數(shù)的變化。Eaton及其同事報道了用于流池法PVT的早期開發(fā)，將水楊酸片作為候選參考標準片，其中研究了流速、溫度、玻璃珠的數(shù)量和大小、脫氣水平、片劑方向、儀器制造商和分析人員。然而，從政策的角度來看，世界上還沒有廣泛接受的機械檢驗準則和PVT標準。

目前的研究范圍是開發(fā)用于流池法裝置的PVT，其中將評估影響溶出的主要變量并確定PVT的初步接受標準。水楊酸片劑具有不崩解、無毒、性能穩(wěn)定性好等特點，有望成為理想的試驗藥物，Eaton等人已成功將其用于PVT的開發(fā)。更重要的是，目前中國的籃法、槳法和小杯法PVT均采用水楊酸片，保證了片劑的質(zhì)量，也為未來的流池法的PVT提供了良好的依從性。

研究分為兩個階段：第一階段采用實驗設(shè)計(DoE)方法，系統(tǒng)考察各參數(shù)對水楊酸溶出度的影響，一個有力統(tǒng)計工具，用于確定過程中各因素和響應(yīng)之間的相關(guān)性。在第二階段，參考美國藥典（USP）1法和2法的PVT分析方法，將由不同的分析人員在不同儀器上進行重復(fù)性和重現(xiàn)性評估，獲得并應(yīng)用流動池（4法）PVT的初步驗收標準。

二、方法

2.1 材料

使用的材料和試劑如下：水楊酸標準品（99.8%，批號100106202106，中國食品藥品監(jiān)檢定研究院），水楊酸標準片（見表1，批號100103-202114，中國食品藥品監(jiān)檢定研究院），磷酸二氫鉀（99.5%，批號68887172，中國邁瑞爾），氫氧化鈉（98%，批號78687053，中國邁瑞爾），超純水（電阻率18.2 MΩ·cm, 25°C），玻璃纖維過濾膜GF/F（直徑25mm，批號9817071，GE醫(yī)療生命科學(xué)Whatman，中國制造）。對片劑的理化性質(zhì)進行了評估，結(jié)果見表1。

表1. 水楊酸片的理化特性

2.2 溶出介質(zhì)和標準溶液

稱取47.6克磷酸二氫鉀和11.06克氫氧化鈉溶于7升超純水中。調(diào)節(jié)溶液的pH值在7.4±0.05范圍內(nèi). 用磁力攪拌器攪拌加熱至45℃，用真空泵脫氣5分鐘（壓力低于100毫巴）。

制備水楊酸對照品儲備液，稱取20mg的水楊酸標準品至250ml容量瓶中。用約1ml乙醇溶解水楊酸粉末，用溶出介質(zhì)定容至250ml。

 制備水楊酸對照品溶液，移取10 mL儲備液液至50 mL容量瓶中，溶出介質(zhì)定容至50ml。

2.3 溶出度試驗第一階段：影響溶出度的變量研究

第一階段的目標是：

1）研究主要變量對溶出度結(jié)果的潛在影響；

2）為第二階段的重現(xiàn)性和重復(fù)性評估確定合適的實驗條件。

通過初步實驗(數(shù)據(jù)未顯示)，初步確定了4個參數(shù)作為自變量：池體內(nèi)徑(ID)、流速、溫度、裝片方式。其他變量包括介質(zhì)成分、體積、脫氣方法、流通池的配置、玻璃珠加入量和泵脈沖，在本研究中未進行調(diào)查。

采用DoE方法系統(tǒng)地研究了四個選定變量在溶出度檢測中的貢獻。采用JMP 13軟件（SAS Institute Inc.， USA）進行DoE和數(shù)據(jù)分析（殘差最大似然[REML]法）。以水楊酸的溶出度為因變量，進行定制設(shè)計。對于四個自變量，將池體ID設(shè)置為兩個水平（12和22.6 mm）的分類變量；流速設(shè)為離散變量，分別為8、16、32 mL/min三個水平；溫度設(shè)為連續(xù)變量，分別為3個水平（35、37、39℃），裝片方式設(shè)為分類變量，分別為4個水平（片劑在片劑架上且錐體處含玻璃珠[HWB]、片劑在片劑架上錐體處無玻璃珠[HWOB]、片劑在玻璃珠床層頂部[T]、片劑內(nèi)埋在玻璃珠中[E]）。考慮到參數(shù)調(diào)整的難度，將裝片模式設(shè)置為簡單，而其他的設(shè)置都是困難的。個體變量的主要效應(yīng)和二次交互效應(yīng)分析了各變量組合與因變量的相關(guān)性。DoE矩陣由33個試驗組成，分布在11個區(qū)塊（補充材料，表S1）。每次試驗均參照該矩陣設(shè)置合適的儀器參數(shù)。

溶出測試在Sotax CE 7smart系統(tǒng)（固件2.40）上進行，該系統(tǒng)與CP7-35活塞泵和C615組分收集器（Sotax AG，瑞士）相結(jié)合。在測試之前，將泵的流量驗證到規(guī)定值（基于初步實驗使用的流量）。所有七個通道的流量最大偏差應(yīng)小于2%，以滿足驗證標準。

圖1：片劑在片劑架上且錐體處含玻璃珠[HWB]、片劑在片劑架上錐體處無玻璃珠[HWOB]、片劑在玻璃珠床層頂部[T]、片劑內(nèi)埋在玻璃珠中[E]

圖1展示了四種片劑裝載方式。對于HWB模式，詳細操作如下。將一顆紅寶石和一勺玻璃珠（直徑1mm）依次放入池體中，然后將一片藥片放在藥片支架上，然后將GF/F過濾膜組裝在池體頂部。HWOB模式與HWB相同，只是沒有玻璃珠。T模式也很像HWB，除了把片劑放在玻璃珠床層上而不是放在片劑支架上。對于E模式，首先將藥片放在一勺玻璃珠床層頂部，然后在池體的剩余空間中填充玻璃珠。溶出試驗的其他參數(shù)保持相同，包括7個通道，每個通道900 mL溶出介質(zhì)，閉環(huán)配置，泵脈沖120 r/min，在10、30、60、90和120分鐘收集2.5 mL樣品溶液。

2.4 溶出度試驗第二階段：重復(fù)性和再現(xiàn)性評估

第二階段的目的是：1）評價水楊酸片作為流池法PVT標準片的可行性；2）考察溶出度試驗的重復(fù)性和重現(xiàn)性；3）確定PVT的初步驗收標準。溶出試驗在兩個試驗裝置中進行。在第二階段測試中四名分析人員和五個組件（Sotax CE 7智能系統(tǒng)，制造年份從2013年到2021年不等）。一個分析人員和一個組裝人員的組合被稱為合作者。通過這種方式，來自同一合作者的數(shù)據(jù)由同一程序集中的同一分析人員獲得。總共有五個合作者。來自四位合作者的數(shù)據(jù)被用來確定PVT的初步接受標準，第五位合作者根據(jù)該接受標準進行PVT。所有實驗在相同的條件下進行，如第一階段所確定的：12 mm池體ID，16 mL/min流速，37℃， HWB片劑裝載模式，7通道，每通道900 mL介質(zhì)，閉環(huán)配置，泵脈沖120 r/min，在10、30、60、90和120分鐘收集2.5 mL樣品溶液。

在本研究中，建立了流池法裝置PVT的單階和兩階試驗的初步可接受范圍。分析方法與USP 1法和2法的PVT相似。評估了三個方差成分：合作者間、實驗間和殘差（實驗內(nèi)）。繪制水楊酸片劑溶出百分數(shù)的總體分布規(guī)律（補充資料，圖S1）。數(shù)據(jù)分布尾部不均勻，與1法和2法的結(jié)果相似。因此，采用自然對數(shù)尺度來改善溶出度值分布（轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布）的對稱性。

對于單階試驗，初步接受限由溶解百分比值（對數(shù)值）的平均值±t SD確定，其中t為95%置信度系數(shù)，SD為可重復(fù)性標準差。以7通道裝配（Sotax CE 7smart系統(tǒng)）為例，將測試兩組7片（共14片），初步驗收限值為：

在Eq. 1中，exp代表指數(shù)，其中均值和方差(S2)通過重復(fù)性和重現(xiàn)性評估估計。下標C、E和R分別表示合作者間、實驗間和剩余方差成分。在本研究中，t = 2.776，在均值的SD中有4個自由度。對于對數(shù)尺度的實驗內(nèi)方差，其上限為F× ，其中F1為F分布的5%上限。在本研究中，F(xiàn) = 1.933，七通道的分子自由度為12，實驗內(nèi)分母自由度為55。原始百分比溶出度的變異系數(shù)（%CV）用對數(shù)正態(tài)公式對自然對數(shù)標度的方差進行變換得到的：

采用單階試驗，需進行2次試驗，14片（7片/次× 2次）的數(shù)據(jù)根據(jù)單階試驗的初步驗收限度進行評價。

對于雙階實驗，有兩個初步驗收限制，每個階段一個。階段1的評估類似于單級檢驗，使用80%的置信度而不是95%的置信度，這將縮小區(qū)間。第一階段測試更嚴格的初步驗收限制將確保評估PVT中首次運行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計能力。在雙階實驗的第二階段，確定初步驗收限制以保持單階段測試通過的概率(95%置信度)。因此，將第1階段和第2階段獲得的數(shù)據(jù)結(jié)合起來進行評估，得到第2階段的初步驗收限度，其值應(yīng)與單階試驗的值相同。

2.5 檢測

采用紫外-可見光譜法測定介質(zhì)中水楊酸的濃度，使用兩臺紫外-可見光譜儀:UV/VIS Excellence UV7 （Mettler-Toledo GmbH，瑞士），軟件版本為3.0.1；Cary 3500 UV-VIS Engine （Agilent Technologies，馬來西亞制造），軟件版本為Cary UV Workstation版本1.1.298。每個樣品（2.5 mL）用空白溶液稀釋5倍至12.5 mL，使用石英比色皿（10mm光程）在296 nm處測定吸光度。

三、討論與結(jié)果

以水楊酸片為標準片的可行性分析

水楊酸片的溶出機制為不崩解和溶蝕，用籃槳法溶出儀進行溶出試驗證實了這一點。在本研究中，收集了5個時間點（10、30、60、90和120 min）的組分，并采用分光光度法測定其API濃度。以時間為自變量，對溶出度數(shù)據(jù)進行線性回歸分析。所有33項試驗均達到極好的線性；31個試驗的相關(guān)系數(shù)為0.9911-0.9999，另外2個試驗的相關(guān)系數(shù)為0.9742和0.9878。說明水楊酸片在流池法裝置中的溶出過程為零級釋放機制，與在籃法和槳法裝置中的一致。盡管在不同條件下進行了33次試驗，但該機制不受流經(jīng)池體參數(shù)調(diào)整的影響。因此，水楊酸片具有足夠穩(wěn)定的理化性質(zhì)，可作為流池法溶出儀中PVT的參考標準片。

通過計算RSD分析33個試驗溶出度數(shù)據(jù)的波動。對于五個時間點，RSD結(jié)果令人滿意，中位數(shù)和第三四分位數(shù)RSD值分別為2.7%和4.9%。僅觀察到少數(shù)高RSD值，這可能是由于第一階段篩選參數(shù)未優(yōu)化以及平行實驗數(shù)量較少（n = 2）造成的。但90 min時RSD值均小于10%，相對穩(wěn)定。考慮到PVT方法的效率，選擇90 min作為后續(xù)分析的關(guān)鍵時間點。這些數(shù)據(jù)見補充資料(表S2-S4)。

表2. 個體變量的初始效應(yīng)和二次交互效應(yīng)

表2顯示了四個單獨參數(shù)的影響及其相互作用。三個參數(shù)及其配對相互作用表現(xiàn)出顯著差異(p < 0.01)。片劑裝載方式是影響溶出度的最重要參數(shù)。流速和池體ID也有顯著影響。然而，溫度對溶解的影響可以忽略不計。

圖3. 用數(shù)學(xué)模型預(yù)測了四個參數(shù)對水楊酸片溶出度的影響。片劑裝載方式HWB為片劑在片劑架上且錐體處含玻璃珠、HWOB為片劑在片劑架上錐體處無玻璃珠、T為片劑在玻璃珠床層頂部、E為片劑內(nèi)埋在玻璃珠中[E]

圖3顯示了這四個參數(shù)的詳細趨勢。E型溶出度最高，T型溶出度居中，HWB型和HWOB型溶出度最低（相近），流速與溶出值成正比關(guān)系。對于池體ID，12mm的溶出值始終高于22.6 mm。這三種趨勢可歸因于水楊酸在流池法裝置中的零級釋放機制。在不崩解的情況下，水楊酸片的溶蝕速度與體積流速成正比。在相同流速下，內(nèi)徑和截面積越小的池體線速度越高，對片劑的侵蝕效應(yīng)越大。同樣，充滿玻璃珠的空間有更小的橫截面積可供流動通過，這導(dǎo)致了更高的線速度。在E型和T型模式中，放置片劑的空間分別全部和部分填充了玻璃珠。對于HWB和HWOB模式（分別有或沒有玻璃珠），放置藥片的空間沒有填充任何玻璃珠。因此，線速度依次為E、T、HWB/ HWOB，與其溶出速度變化趨勢相同。

在第二階段，我們選擇了一個具有適當(dāng)?shù)娜艹鲋岛洼^小的實驗內(nèi)方差的實驗條件進行重復(fù)性和重現(xiàn)性評估，以確定流池法裝置PVT的初步驗收標準。與其他裝模式相比，HWB模式的實驗內(nèi)方差（數(shù)據(jù)未顯示）最小。為了保持流池法裝置的溶出值與籃法和槳法裝置的溶出值相當(dāng)，選擇了12 mm ID池體和16 mL/ min流速的組合。因此，確定第二階段實驗條件：以HWB型放置片劑，流速為16ml /min，流速為12mm，溫度為37℃，90分鐘取樣。該實驗條件未納入33項初步試驗，其性能根據(jù)JMP軟件建立的上述數(shù)學(xué)模型進行計算和預(yù)測。該條件下的溶出度估算值為22.2%，與中國藥典中水楊酸PVT片的籃法 （21-26%）和槳法（20-26%）裝置的驗收標準相似。將該估計值與實驗測量值進行了比較，驗證了數(shù)學(xué)模型的擬合性。

對于重復(fù)性和重現(xiàn)性評估，表3列出了對應(yīng)于Eq. 1中參數(shù)的溶出度的平均值和方差。流池法的PVT的初步驗收標準由式1計算，見表4，包括單階和雙階測試。數(shù)學(xué)模型的預(yù)測值為22.2%，在初步可接受標準范圍內(nèi)。預(yù)測值22.2%與實驗平均值24.5%的絕對誤差僅為2.3%，表明DoE生成的數(shù)學(xué)模型是指導(dǎo)和預(yù)測實驗的有力工具。

第五個合作者的數(shù)據(jù)證實了成功的重復(fù)性。第一次試驗的平均溶出值和%CV分別為23.8%和1.5%。這些數(shù)據(jù)滿足初步驗收標準（表4），因此不需要進行第二次實驗。

表3. 重復(fù)性和再現(xiàn)性評估中的溶解值和方差

表4. 流池法（7通道）PVT初步驗收標準

未來的合作研究應(yīng)該有更大的覆蓋范圍，包括來自監(jiān)管機構(gòu)、制藥公司、CRO和儀器制造商的實驗室。考慮到差異，ISO指南21748規(guī)定了參與協(xié)作研究的實驗室的最少數(shù)量為15個自由度。

四、結(jié)論

在本次雙階實驗研究中，水楊酸片被用于開發(fā)流池法裝置的PVT，它遵循與籃法和槳法裝置相同的溶蝕和零級釋放機制。因此，水楊酸片可作為流池法溶出儀PVT的潛在標準參比片。本研究第一階段發(fā)現(xiàn)，影響溶出度的最重要因素是片劑的裝載方式，其次是流速和細胞內(nèi)徑；然而，溫度沒有顯著的影響。第2階段通過以下實驗條件（基于第1階段實驗）確定了流池法PVT的初步驗收標準：將片劑放置在帶有玻璃珠的片劑架上，池體ID為12 mm，流速為16 mL/min， 37℃下90分鐘。重復(fù)性和重現(xiàn)性評估由不同的分析人員在兩個測試設(shè)施的不同設(shè)備上進行了確認。本研究建立了一個流池法溶出裝置的初步的可接受限度溶出PVT。水楊酸片對流池法裝置操作參數(shù)的敏感性需要在較窄的范圍內(nèi)和更多的合作者進行進一步的研究。

五、參考文獻

略

如需原文，請聯(lián)系小編（代老師15012941165）