作者：范詩雨，劉芳伶，賀勁杰，周群，程澤能

摘 要

目的  通過流通池法模擬富馬酸喹硫平緩釋制劑的體內動力學過程，建立具有體內外相關性的溶出方法，并進行體內外相關性模型預測能力的評估。

方法  采用HPLC-MS/MS 法測得T1、T2 和R制劑的血藥濃度數據，通過WinNonlin軟件的非房室模型和反卷積模塊解析參比制劑的體內特征，依據參比制劑的體內特征指導溶出方法的設計，用3 種釋放速率不同的制劑的體內和體外數據建立體內外相關性模型，并進行模型預測能力驗證。

結果  建立了具有A級相關性(R2=0.967)和C級相關性(R2=0.996)的溶出方法，內部制劑預測和外部制劑預測的預測誤差PE%<10%，符合標準。

結論  本方法具有良好的體內外相關性，其體內外相關性模型經驗證預測誤差符合標準，對于吸收速率不同的制劑均具有良好的區分力，可以為富馬酸喹硫平緩釋片的制劑評價提供參考。

關 鍵 詞

01   簡 介

富馬酸喹硫平是英國AstraZeneca制藥公司新開發的第二代非典型抗精神病藥（second genera-tion antipsychotics，SGA）。其緩釋制劑可以延長藥物治療作用持續時間，降低毒副作用，減少用藥次數，改善用藥的依從性。該藥物于2013年在中國上市，由于其仿制難度較大，目前國內僅有3家仿制制劑為在售狀態。體內外相關性（in vitro-in vivo correlation，IVIVC）模型是一種用于描述口服劑型體外特性（藥物溶解或釋放的程度）與體內性能（血漿藥物的溶度和吸收量）之間相關性的數學模型。依據IVIVC模型對藥物體內時間-血漿藥物濃度曲線的擬合程度，FDA指南將IVIVC劃分為A、B、C和多重C級4個級別。

本研究以富馬酸喹硫平緩釋片為研究對象，依據體內藥動學特征來設計體外溶出方法，并初步建立和評估了該藥物的體內外相關性模型。基于新型流通池法建立富馬酸喹硫平緩釋片具有體內外相關性的溶出方法，依據藥物體外溶出行為來模擬預測藥物的體內性能，這不僅有助于提高該制劑的生物等效性試驗的成功率、節約仿制藥研發成本、節省注冊時間，還可以被用于建立體外溶出度標準，進行藥品批間質量控制等。

02  儀器與試藥

全自動流通池型溶出儀（推薦使用華溶儀器DS-7CP PLUS 流池法溶出系統）；高效液相色譜儀（Agilent1260，配有 DAD 檢測器）；UX6200H 型百分之一電子天平 [島津企業管理（中國）有限公司 ]；十萬分之一電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司 ]；HH-6 型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；Vortex-5型可調式渦旋混合器（山海嘉鵬科技有限公司）；TG20-WS 臺式低速離心機（湖南邁克爾實驗儀器有限公司）；FE28 型 pH 計[梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司]，Eco-S15UVFV型實驗室純水系統（上海和泰儀器有限公司）。

受試制劑T1、T2（某公司自研產品，規格：200mg）；受試制劑T3（某市售制劑，規格：200 mg）；受試制劑T4（某市售制劑，規格：200mg）；富馬酸喹硫平緩釋片（R，阿斯利康制藥有限公司，批號：MM2654、MK2374）；富馬酸喹硫平原料藥（浙江蘇泊爾制藥有限公司，批號：011-180305U），磷酸二氫鉀（上海滬試，批號：20220110），氫氧化鈉（上海滬試，批號：20210107），磷酸（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20210710）；三乙胺（廣州光華科技股份有限公司，批號：20200809）；鹽酸（成都市科隆化學品有限公司，批號：2020112502）；富馬酸喹硫平對照品（純度：96.2%，批號：2413-025A2）、富馬酸喹硫平內標（純度：95.7%，批號：3298-096A6）（TLC pharmaceutical Standards）；甲醇、乙腈、乙腈均為色譜純。

03   方法與結果

3.1 藥物體內試驗

3.1.1   T1與R的人體生物等效性試驗

采用隨機、開放、兩制劑、兩周期（T-R、R-T）、自身交叉試驗設計，周期間的洗脫期為7d。試驗方案經海口市人民醫院生物醫學倫理委員會 [ 倫理批準號：2021-（倫審）-172] 批準，受試者均簽署知情同意書。48 例受試者在試驗當日早上空腹口服 T1 或 R 一片，于給藥前（0 h）及給藥后 0.5、 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、18、20、24、28、32、36、48 h 分別采集靜脈血 4 mL，血樣置于肝素鈉抗凝劑真空采血管中，1h 內離心分離血漿，血樣放于超低溫冰箱（低于－ 60 ℃）中儲存待分析，采用高效液相- 質譜聯用（HPLC-MS/MS）測定人體血漿喹硫平濃度，采用 WinNonlin軟件非房室模塊計算富馬酸喹硫平的藥動學參數。

3.1.2　T2與R的人體生物等效性試驗

采用隨機、開放、兩制劑、兩周期（T-R、R-T）、自身交叉試驗設計，周期間的洗脫期為7d。試驗方案經南華大學附屬第二醫院藥物臨床試驗倫理委員會[ 倫理批準號：【202106-03】藥倫審字（191）號]批準，受試者均簽署知情同意書。48例受試者在試驗當日早上空腹口服T2或R一片，于給藥前（0h）及給藥后 0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、24、 28、32、36、48h分別采集靜脈血4mL，血樣置于肝素鈉抗凝劑真空采血管中，1h內離心分離血漿，血樣放于超低溫冰箱（低于－60 ℃）中儲存待分析，采用HPLC-MS/MS測定人體血漿喹硫平濃度。

3.1.3　生物樣本檢測

① 色譜條件。

色譜柱：Waters XBridge C18（4.6mm×50mm，3.5μm），流速：0.6 mL·min；進樣量：10μL；柱溫：35℃；流動相：0.1%甲酸水溶液為A泵，甲醇為B泵；梯度洗脫：0.00～1.00 min，80%A；1.00～1.5min，80%→10%A；1.5～4.5 min，10%A；4.5～4.6min，10%→80%A。

② 質譜條件。

離子源：電噴霧離子源ESI；檢測方式：正離子MRM 模式；離子源噴霧電壓：4000V；離子源溫度：300 ℃；碰撞能：喹硫平內標和喹硫平的碰撞能均為25V；監測離子對：喹硫平內標的檢測離子為m/z 392.2～258.1，喹硫平的檢測離子為m/z 384.2～253.1。

HPLC-MS/MS法測得各制劑單位時間的平均血藥濃度檢測結果見圖1a、圖1b，將各制劑的血藥濃度 -時間曲線數據代入WinNonlin 軟件中的反卷積模塊可求得各制劑的各時間點的吸收百分數圖（見圖1c），各制劑的吸收速度和吸收程度差異明顯，T1＞R＞T2。采用非房室模塊計算富馬酸喹硫平的藥動學參數，比較T1、T2和R制劑的Cmax、AUC0～t和AUC0～∞的幾何均值比Ratio（T2/R）和Ratio（T1/R），結果也說明在體內試驗中T1的吸收程度比R高、吸收速度比R快，T2的吸收程度比R低、吸收速度比R慢（見表1、2）。

圖 1　平均血藥濃度 - 時間曲線圖（a 和 b）和體內累積吸收百分數圖（c）

表 1　T1 和R 的人體試驗藥動學參數

表 2　T2 和R 的人體試驗藥動學參數

3.2  藥物體外溶出試驗

3.2.1　藥物溶出度測定

由參比制劑體內藥動學參數可知，富馬酸喹硫平緩釋片的體內吸收速率常數Ka約為0.27，3倍吸收半衰期3t1/2約為8h，該數據提示富馬酸喹硫平參比制劑8h的累積吸收超過85%。以此為依據，采用流通池法，溶出介質前3h為pH1.2的鹽酸溶液，3h后為純化水介質，流速20 mL·min，溫度（37±0.5）℃，分別于0.5、1、2、3、4、5、6、7、8h接取1mL左右的溶出液，進行10 000 r·min，3 min的離心后，取上清液，采用HPLC法進行檢測，得到的喹硫平的微分溶出曲線通過數值積分法轉換為累積溶出百分數曲線，轉換公式如下：

其中，Diss為累積溶出百分數，dosage為藥物活性成分總含量，Ci 為ti 時間點的藥物濃度，Flowrate為溶出介質流速。

3.2.2　樣本檢測

使用HPLC檢測樣品中藥物濃度，色譜柱：Agilent 5 TC-C18（2）（150mm×4.6mm）；流動相：甲醇-水- 三乙胺（600∶400∶4），調節pH至4.5；檢測波長：289nm；流速：1mL·min；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL。

結果R、T1、T2 的8h體外累積溶出曲線和溶出速度具有明顯的差異，T1比R的溶出速率快，但T2比R的溶出速率略慢（見圖2），該試驗結果與各制劑體內試驗不同時間的吸收百分數呈相同趨勢（見圖1c）。

3.2.3　體內外相關性的建立和評估

依據體內外相關性模型計算體內預測累積吸收百分數，再根據卷積分法計算體內預測血藥濃度，具體公式如下：

圖 2　T1、T2 和R的8h體外累積溶出百分數圖（n＝6）

其中，Δ F是兩個連續的取樣時間點之間的累積溶出分數差，Δ t是兩個連續的取樣時間點之差，D是藥物活性成分總含量，Vd是藥物的表觀分布容積，Ke是消除速率常數。

采用WinNonlin軟件計算累積吸收分數（Abs，%），以三個制劑各時間點的體外累積溶出百分數（Diss，%）為橫坐標，以對應時間點的體內累積吸收數據（Abs，%）為縱坐標進行線性分析，可得到T1、T2和R的體內外A級相關性模型（Abs＝0.945×Diss＋0.337，R2＝0.967）。該結果表明該溶出方法具有A級體內外相關性（見圖3a）。

使用DDsolver 程序對富馬酸喹硫平緩釋片的溶出數據進行分析可知其體外溶出特征符合Weibull模型，并得到各制劑累積溶出80%的時間T80，以T80為橫坐標，體內實測的AUC0～t為縱坐標進行相關性分析，可得到三個制劑的C級相關圖（見圖3b）。

圖 3　T1、T2和R的A級（a）及T1、T2和R的C級體內外相關性圖（b）

依據模型Abs＝0.945×Diss＋0.337，R2＝0.967，由T1、T2 和R的體外累積溶出百分數可預測三個制劑的體內吸收百分率，由體內吸收百分率通過卷積法可得到制劑的時間-血藥濃度數據，進而得到Cmax 和AUC0～t預測的幾何均值比Ratio（T/R），并分別計算Ratio（T1/R）和Ratio（T2/R）的預測誤差率，T2制劑Cmax的Ratio（T2/R）為12.7%＞10%（見表3），需繼續進行外部制劑預測能力評估。

表 3　T1、T2 模型預測值與實測值的比較

為進一步評估模型的可預測能力，使用市售制劑T3、T4 進行模型外部制劑預測能力評估。依據T1和T2建立的IVIVC模型（Abs＝0.945×Diss＋0.337，R2＝0.967），由制劑T3、T4的體外數據各時間點的Diss（見圖4）預測制劑T3、T4 體內各時間點的體內吸收百分率Abs%，進而得到Cmax和AUC0～t預測的幾何均值比Ratio（T3/R）、Ratio（T4/R），將市售制劑T3、T4的實測值默認為100%，計算預測誤差率PE%，結果見表4。兩制劑Cmax 和AUC0～t 預測誤差率均小于10%，說明該模型的預測能力良好。

圖 4　參比制劑R 和受試制劑T3、T4 的體外累積溶出圖（n ＝ 6）

表 4　受試制劑T3、T4 的模型預測值與實測值的比較(%)

04   討 論

文獻報道富馬酸喹硫平原料藥溶出呈現明顯的pH依賴性，溶解度隨著pH值的降低而增大，而人體胃腸道存在由酸性胃液到堿性腸液的過渡過程，考慮到胃腸道pH變化可能對藥物溶出速率產生的影響，本研究選擇了pH 1.2的溶液和純化水作為溶出介質，并且在3h的時間點進行了介質的轉換。相比經典的籃法和槳法，本研究選用的為流通池法，流通池的動力學過程與體內的流體動力學過程更為相似，對于需要進行介質轉換的試驗，流通池的儀器構造比起籃法和槳法有更多的可操作性。對體內吸收數據的解析也驗證了上述設計的必要性，將體內數據和體外數據進行線性擬合后，A級相關和C級相關的擬合優度R2均大于0.9，也說明了該溶出設計的合理性。

本研究的體內試驗分為兩個獨立的試驗進行，雖然各試驗使用的參比制劑的廠家和批號相同，但在不同的試驗中得出的藥動學參數的具體數值仍差異較大，如參比制劑R在“T1與R的人體生物等效性試驗”中的AUC0～t和Cmax值均比“T2和R的人體生物等效性試驗”中的參數值大，為了減少誤差，在進行內部預測和外部預測時選用的藥動學參數是幾何均值比 Ratio（T/R）這類比率值；在進行C級體內外相關性分析時使用的T2制劑的AUC0～t也通過Ratio（T2/R）進行了換算。

目前，文獻關于IVIVC研究偏重于其所建立的溶出方法與體內數據的相關性，以線性相關方程和擬合優度R2作為IVIVC研究的結果指標。實際上，IVIVC模型作為一種預測性的模型，其預測能力的評估也是IVIVC研究的重點，FDA建議對于三種釋放速率不同的制劑建立的IVIVC模型至少應進行建模制劑內部預測能力的評估，對于兩種釋放速率不同的制劑進行模型外部制劑預測能力的評估。本研究以三種釋放速率不同的制劑建立IVIVC模型，進行內部制劑評估后發現T2制劑Cmax的Ratio（T2/R）的預測誤差為12.7%，略微超出10%的評價標準，進一步用外部制劑T3和T4對模型進行了評估，外部制劑預測誤差均小于10%，符合評價標準，說明模型具有良好的預測性。

05   結 論

本研究依托流通池法創建富馬酸喹硫平緩釋片體內外相關性良好的體外溶出方法，對于吸收速率不同的制劑均具有良好的區分力，可為富馬酸喹硫平緩釋片質量標準的建立提供依據。建立的IVIVC模型經內部驗證和外部驗證顯示其具有良好的可預測性，可通過富馬酸喹硫平緩釋片制劑的體外特征預測制劑的體內特征，在制劑評價、處方優化等方面都有重要的應用價值。

06  參考文獻

略