作者：范詩雨，劉芳伶，賀勁杰，周群，程澤能

摘 要

目的  通過流通池法模擬富馬酸喹硫平緩釋制劑的體內(nèi)動力學(xué)過程，建立具有體內(nèi)外相關(guān)性的溶出方法，并進行體內(nèi)外相關(guān)性模型預(yù)測能力的評估。

方法  采用HPLC-MS/MS 法測得T1、T2 和R制劑的血藥濃度數(shù)據(jù)，通過WinNonlin軟件的非房室模型和反卷積模塊解析參比制劑的體內(nèi)特征，依據(jù)參比制劑的體內(nèi)特征指導(dǎo)溶出方法的設(shè)計，用3 種釋放速率不同的制劑的體內(nèi)和體外數(shù)據(jù)建立體內(nèi)外相關(guān)性模型，并進行模型預(yù)測能力驗證。

結(jié)果  建立了具有A級相關(guān)性(R2=0.967)和C級相關(guān)性(R2=0.996)的溶出方法，內(nèi)部制劑預(yù)測和外部制劑預(yù)測的預(yù)測誤差PE%<10%，符合標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié)論  本方法具有良好的體內(nèi)外相關(guān)性，其體內(nèi)外相關(guān)性模型經(jīng)驗證預(yù)測誤差符合標(biāo)準(zhǔn)，對于吸收速率不同的制劑均具有良好的區(qū)分力，可以為富馬酸喹硫平緩釋片的制劑評價提供參考。

關(guān) 鍵 詞

01   簡 介

富馬酸喹硫平是英國AstraZeneca制藥公司新開發(fā)的第二代非典型抗精神病藥（second genera-tion antipsychotics，SGA）。其緩釋制劑可以延長藥物治療作用持續(xù)時間，降低毒副作用，減少用藥次數(shù)，改善用藥的依從性。該藥物于2013年在中國上市，由于其仿制難度較大，目前國內(nèi)僅有3家仿制制劑為在售狀態(tài)。體內(nèi)外相關(guān)性（in vitro-in vivo correlation，IVIVC）模型是一種用于描述口服劑型體外特性（藥物溶解或釋放的程度）與體內(nèi)性能（血漿藥物的溶度和吸收量）之間相關(guān)性的數(shù)學(xué)模型。依據(jù)IVIVC模型對藥物體內(nèi)時間-血漿藥物濃度曲線的擬合程度，F(xiàn)DA指南將IVIVC劃分為A、B、C和多重C級4個級別。

本研究以富馬酸喹硫平緩釋片為研究對象，依據(jù)體內(nèi)藥動學(xué)特征來設(shè)計體外溶出方法，并初步建立和評估了該藥物的體內(nèi)外相關(guān)性模型。基于新型流通池法建立富馬酸喹硫平緩釋片具有體內(nèi)外相關(guān)性的溶出方法，依據(jù)藥物體外溶出行為來模擬預(yù)測藥物的體內(nèi)性能，這不僅有助于提高該制劑的生物等效性試驗的成功率、節(jié)約仿制藥研發(fā)成本、節(jié)省注冊時間，還可以被用于建立體外溶出度標(biāo)準(zhǔn)，進行藥品批間質(zhì)量控制等。

02  儀器與試藥

全自動流通池型溶出儀（推薦使用華溶儀器DS-7CP PLUS 流池法溶出系統(tǒng)）；高效液相色譜儀（Agilent1260，配有 DAD 檢測器）；UX6200H 型百分之一電子天平 [島津企業(yè)管理（中國）有限公司 ]；十萬分之一電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司 ]；HH-6 型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；Vortex-5型可調(diào)式渦旋混合器（山海嘉鵬科技有限公司）；TG20-WS 臺式低速離心機（湖南邁克爾實驗儀器有限公司）；FE28 型 pH 計[梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司]，Eco-S15UVFV型實驗室純水系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）。

受試制劑T1、T2（某公司自研產(chǎn)品，規(guī)格：200mg）；受試制劑T3（某市售制劑，規(guī)格：200 mg）；受試制劑T4（某市售制劑，規(guī)格：200mg）；富馬酸喹硫平緩釋片（R，阿斯利康制藥有限公司，批號：MM2654、MK2374）；富馬酸喹硫平原料藥（浙江蘇泊爾制藥有限公司，批號：011-180305U），磷酸二氫鉀（上海滬試，批號：20220110），氫氧化鈉（上海滬試，批號：20210107），磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20210710）；三乙胺（廣州光華科技股份有限公司，批號：20200809）；鹽酸（成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號：2020112502）；富馬酸喹硫平對照品（純度：96.2%，批號：2413-025A2）、富馬酸喹硫平內(nèi)標(biāo)（純度：95.7%，批號：3298-096A6）（TLC pharmaceutical Standards）；甲醇、乙腈、乙腈均為色譜純。

03   方法與結(jié)果

3.1 藥物體內(nèi)試驗

3.1.1   T1與R的人體生物等效性試驗

采用隨機、開放、兩制劑、兩周期（T-R、R-T）、自身交叉試驗設(shè)計，周期間的洗脫期為7d。試驗方案經(jīng)海口市人民醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)倫理委員會 [ 倫理批準(zhǔn)號：2021-（倫審）-172] 批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。48 例受試者在試驗當(dāng)日早上空腹口服 T1 或 R 一片，于給藥前（0 h）及給藥后 0.5、 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、18、20、24、28、32、36、48 h 分別采集靜脈血 4 mL，血樣置于肝素鈉抗凝劑真空采血管中，1h 內(nèi)離心分離血漿，血樣放于超低溫冰箱（低于－ 60 ℃）中儲存待分析，采用高效液相- 質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）測定人體血漿喹硫平濃度，采用 WinNonlin軟件非房室模塊計算富馬酸喹硫平的藥動學(xué)參數(shù)。

3.1.2　T2與R的人體生物等效性試驗

采用隨機、開放、兩制劑、兩周期（T-R、R-T）、自身交叉試驗設(shè)計，周期間的洗脫期為7d。試驗方案經(jīng)南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥物臨床試驗倫理委員會[ 倫理批準(zhǔn)號：【202106-03】藥倫審字（191）號]批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。48例受試者在試驗當(dāng)日早上空腹口服T2或R一片，于給藥前（0h）及給藥后 0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、24、 28、32、36、48h分別采集靜脈血4mL，血樣置于肝素鈉抗凝劑真空采血管中，1h內(nèi)離心分離血漿，血樣放于超低溫冰箱（低于－60 ℃）中儲存待分析，采用HPLC-MS/MS測定人體血漿喹硫平濃度。

3.1.3　生物樣本檢測

① 色譜條件。

色譜柱：Waters XBridge C18（4.6mm×50mm，3.5μm），流速：0.6 mL·min；進樣量：10μL；柱溫：35℃；流動相：0.1%甲酸水溶液為A泵，甲醇為B泵；梯度洗脫：0.00～1.00 min，80%A；1.00～1.5min，80%→10%A；1.5～4.5 min，10%A；4.5～4.6min，10%→80%A。

② 質(zhì)譜條件。

離子源：電噴霧離子源ESI；檢測方式：正離子MRM 模式；離子源噴霧電壓：4000V；離子源溫度：300 ℃；碰撞能：喹硫平內(nèi)標(biāo)和喹硫平的碰撞能均為25V；監(jiān)測離子對：喹硫平內(nèi)標(biāo)的檢測離子為m/z 392.2～258.1，喹硫平的檢測離子為m/z 384.2～253.1。

HPLC-MS/MS法測得各制劑單位時間的平均血藥濃度檢測結(jié)果見圖1a、圖1b，將各制劑的血藥濃度 -時間曲線數(shù)據(jù)代入WinNonlin 軟件中的反卷積模塊可求得各制劑的各時間點的吸收百分?jǐn)?shù)圖（見圖1c），各制劑的吸收速度和吸收程度差異明顯，T1＞R＞T2。采用非房室模塊計算富馬酸喹硫平的藥動學(xué)參數(shù)，比較T1、T2和R制劑的Cmax、AUC0～t和AUC0～∞的幾何均值比Ratio（T2/R）和Ratio（T1/R），結(jié)果也說明在體內(nèi)試驗中T1的吸收程度比R高、吸收速度比R快，T2的吸收程度比R低、吸收速度比R慢（見表1、2）。

圖 1　平均血藥濃度 - 時間曲線圖（a 和 b）和體內(nèi)累積吸收百分?jǐn)?shù)圖（c）

表 1　T1 和R 的人體試驗藥動學(xué)參數(shù)

表 2　T2 和R 的人體試驗藥動學(xué)參數(shù)

3.2  藥物體外溶出試驗

3.2.1　藥物溶出度測定

由參比制劑體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)可知，富馬酸喹硫平緩釋片的體內(nèi)吸收速率常數(shù)Ka約為0.27，3倍吸收半衰期3t1/2約為8h，該數(shù)據(jù)提示富馬酸喹硫平參比制劑8h的累積吸收超過85%。以此為依據(jù)，采用流通池法，溶出介質(zhì)前3h為pH1.2的鹽酸溶液，3h后為純化水介質(zhì)，流速20 mL·min，溫度（37±0.5）℃，分別于0.5、1、2、3、4、5、6、7、8h接取1mL左右的溶出液，進行10 000 r·min，3 min的離心后，取上清液，采用HPLC法進行檢測，得到的喹硫平的微分溶出曲線通過數(shù)值積分法轉(zhuǎn)換為累積溶出百分?jǐn)?shù)曲線，轉(zhuǎn)換公式如下：

其中，Diss為累積溶出百分?jǐn)?shù)，dosage為藥物活性成分總含量，Ci 為ti 時間點的藥物濃度，F(xiàn)lowrate為溶出介質(zhì)流速。

3.2.2　樣本檢測

使用HPLC檢測樣品中藥物濃度，色譜柱：Agilent 5 TC-C18（2）（150mm×4.6mm）；流動相：甲醇-水- 三乙胺（600∶400∶4），調(diào)節(jié)pH至4.5；檢測波長：289nm；流速：1mL·min；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL。

結(jié)果R、T1、T2 的8h體外累積溶出曲線和溶出速度具有明顯的差異，T1比R的溶出速率快，但T2比R的溶出速率略慢（見圖2），該試驗結(jié)果與各制劑體內(nèi)試驗不同時間的吸收百分?jǐn)?shù)呈相同趨勢（見圖1c）。

3.2.3　體內(nèi)外相關(guān)性的建立和評估

依據(jù)體內(nèi)外相關(guān)性模型計算體內(nèi)預(yù)測累積吸收百分?jǐn)?shù)，再根據(jù)卷積分法計算體內(nèi)預(yù)測血藥濃度，具體公式如下：

圖 2　T1、T2 和R的8h體外累積溶出百分?jǐn)?shù)圖（n＝6）

其中，Δ F是兩個連續(xù)的取樣時間點之間的累積溶出分?jǐn)?shù)差，Δ t是兩個連續(xù)的取樣時間點之差，D是藥物活性成分總含量，Vd是藥物的表觀分布容積，Ke是消除速率常數(shù)。

采用WinNonlin軟件計算累積吸收分?jǐn)?shù)（Abs，%），以三個制劑各時間點的體外累積溶出百分?jǐn)?shù)（Diss，%）為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)時間點的體內(nèi)累積吸收數(shù)據(jù)（Abs，%）為縱坐標(biāo)進行線性分析，可得到T1、T2和R的體內(nèi)外A級相關(guān)性模型（Abs＝0.945×Diss＋0.337，R2＝0.967）。該結(jié)果表明該溶出方法具有A級體內(nèi)外相關(guān)性（見圖3a）。

使用DDsolver 程序?qū)Ω获R酸喹硫平緩釋片的溶出數(shù)據(jù)進行分析可知其體外溶出特征符合Weibull模型，并得到各制劑累積溶出80%的時間T80，以T80為橫坐標(biāo)，體內(nèi)實測的AUC0～t為縱坐標(biāo)進行相關(guān)性分析，可得到三個制劑的C級相關(guān)圖（見圖3b）。

圖 3　T1、T2和R的A級（a）及T1、T2和R的C級體內(nèi)外相關(guān)性圖（b）

依據(jù)模型Abs＝0.945×Diss＋0.337，R2＝0.967，由T1、T2 和R的體外累積溶出百分?jǐn)?shù)可預(yù)測三個制劑的體內(nèi)吸收百分率，由體內(nèi)吸收百分率通過卷積法可得到制劑的時間-血藥濃度數(shù)據(jù)，進而得到Cmax 和AUC0～t預(yù)測的幾何均值比Ratio（T/R），并分別計算Ratio（T1/R）和Ratio（T2/R）的預(yù)測誤差率，T2制劑Cmax的Ratio（T2/R）為12.7%＞10%（見表3），需繼續(xù)進行外部制劑預(yù)測能力評估。

表 3　T1、T2 模型預(yù)測值與實測值的比較

為進一步評估模型的可預(yù)測能力，使用市售制劑T3、T4 進行模型外部制劑預(yù)測能力評估。依據(jù)T1和T2建立的IVIVC模型（Abs＝0.945×Diss＋0.337，R2＝0.967），由制劑T3、T4的體外數(shù)據(jù)各時間點的Diss（見圖4）預(yù)測制劑T3、T4 體內(nèi)各時間點的體內(nèi)吸收百分率Abs%，進而得到Cmax和AUC0～t預(yù)測的幾何均值比Ratio（T3/R）、Ratio（T4/R），將市售制劑T3、T4的實測值默認為100%，計算預(yù)測誤差率PE%，結(jié)果見表4。兩制劑Cmax 和AUC0～t 預(yù)測誤差率均小于10%，說明該模型的預(yù)測能力良好。

圖 4　參比制劑R 和受試制劑T3、T4 的體外累積溶出圖（n ＝ 6）

表 4　受試制劑T3、T4 的模型預(yù)測值與實測值的比較(%)

04   討 論

文獻報道富馬酸喹硫平原料藥溶出呈現(xiàn)明顯的pH依賴性，溶解度隨著pH值的降低而增大，而人體胃腸道存在由酸性胃液到堿性腸液的過渡過程，考慮到胃腸道pH變化可能對藥物溶出速率產(chǎn)生的影響，本研究選擇了pH 1.2的溶液和純化水作為溶出介質(zhì)，并且在3h的時間點進行了介質(zhì)的轉(zhuǎn)換。相比經(jīng)典的籃法和槳法，本研究選用的為流通池法，流通池的動力學(xué)過程與體內(nèi)的流體動力學(xué)過程更為相似，對于需要進行介質(zhì)轉(zhuǎn)換的試驗，流通池的儀器構(gòu)造比起籃法和槳法有更多的可操作性。對體內(nèi)吸收數(shù)據(jù)的解析也驗證了上述設(shè)計的必要性，將體內(nèi)數(shù)據(jù)和體外數(shù)據(jù)進行線性擬合后，A級相關(guān)和C級相關(guān)的擬合優(yōu)度R2均大于0.9，也說明了該溶出設(shè)計的合理性。

本研究的體內(nèi)試驗分為兩個獨立的試驗進行，雖然各試驗使用的參比制劑的廠家和批號相同，但在不同的試驗中得出的藥動學(xué)參數(shù)的具體數(shù)值仍差異較大，如參比制劑R在“T1與R的人體生物等效性試驗”中的AUC0～t和Cmax值均比“T2和R的人體生物等效性試驗”中的參數(shù)值大，為了減少誤差，在進行內(nèi)部預(yù)測和外部預(yù)測時選用的藥動學(xué)參數(shù)是幾何均值比 Ratio（T/R）這類比率值；在進行C級體內(nèi)外相關(guān)性分析時使用的T2制劑的AUC0～t也通過Ratio（T2/R）進行了換算。

目前，文獻關(guān)于IVIVC研究偏重于其所建立的溶出方法與體內(nèi)數(shù)據(jù)的相關(guān)性，以線性相關(guān)方程和擬合優(yōu)度R2作為IVIVC研究的結(jié)果指標(biāo)。實際上，IVIVC模型作為一種預(yù)測性的模型，其預(yù)測能力的評估也是IVIVC研究的重點，F(xiàn)DA建議對于三種釋放速率不同的制劑建立的IVIVC模型至少應(yīng)進行建模制劑內(nèi)部預(yù)測能力的評估，對于兩種釋放速率不同的制劑進行模型外部制劑預(yù)測能力的評估。本研究以三種釋放速率不同的制劑建立IVIVC模型，進行內(nèi)部制劑評估后發(fā)現(xiàn)T2制劑Cmax的Ratio（T2/R）的預(yù)測誤差為12.7%，略微超出10%的評價標(biāo)準(zhǔn)，進一步用外部制劑T3和T4對模型進行了評估，外部制劑預(yù)測誤差均小于10%，符合評價標(biāo)準(zhǔn)，說明模型具有良好的預(yù)測性。

05   結(jié) 論

本研究依托流通池法創(chuàng)建富馬酸喹硫平緩釋片體內(nèi)外相關(guān)性良好的體外溶出方法，對于吸收速率不同的制劑均具有良好的區(qū)分力，可為富馬酸喹硫平緩釋片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。建立的IVIVC模型經(jīng)內(nèi)部驗證和外部驗證顯示其具有良好的可預(yù)測性，可通過富馬酸喹硫平緩釋片制劑的體外特征預(yù)測制劑的體內(nèi)特征，在制劑評價、處方優(yōu)化等方面都有重要的應(yīng)用價值。

06  參考文獻

略