摘 要
多環芳烴（PAH）是持久性環境污染物，偶爾會作為污染物出現在消費品中。當皮膚接觸時，PAH會轉移到角質層（s.c.）并穿過皮膚遷移，導致這類高毒性化合物具有生物利用性。在本研究中，通過體外Franz擴散池評估了24種PAH（包括廣泛摩爾質量（M：152-302 g/mol）和辛醇-水分配系數（logP：3.9-7.3）范圍）在人類和豬皮膚中的透皮速率。更親脂性且可能毒性更強的PAH通過親脂性較強的角質層向親水性更強的活體（表觀）真皮層的滲透速率降低。此外，人類皮膚的滲透性低于豬皮，豬皮是皮膚滲透研究中常用的替代物。特別是，人類皮膚的角質層保留了更多的PAH，對于較小的PAH，這種效果更為明顯。此外，我們還比較了不同PAH在豬皮中的皮膚滲透動力學。雖然小分子多環芳烴（M < 230 克/摩爾，logP < 6）能迅速滲透皮膚，并在 2 小時后出現在受體液中，但大分子多環芳烴（M > 252 克/摩爾，logP ≥ 6）在長達 48 小時內都無法完全滲透皮膚。這表明，當轉移到皮膚表面時，高親脂性多環芳烴不像其較小的同類物質那樣容易生物利用。我們的數據表明，豬皮可作為評估多環芳烴通過人類皮膚滲透的最壞情況場景的替代物。

01   引 言
多環芳烴（PAH）與眾多健康風險有關（Kamal等人，2015年）。許多PAH被認為具有潛在的致癌性（IARC，2010年、2018年；Kamal等人，2015年；Kim等人，2013年；Rocha等人，2021年；WHO，2010年），包括皮膚接觸后誘發皮膚癌的風險（Boffetta等人，1997年）。例如，苯并[a]芘（B[a] P）被歸類為1級致癌物，而某些二苯并芘則被懷疑是更強的毒素（Collins等人，1998年）。除了癌癥，PAH還與內分泌干擾有關（Zhang等人，2016年）、心臟病（Burstyn等人，2005年）和免疫抑制有關（van Grevenynghe等人，2005年），以及其他不良影響（Sousa等人，2022年；WHO，2010年）。因此，已經實施了多項法規來限制PAH的暴露（EC， 2006年；EC，2013年；EC，2023年；US-EPA，2021年）。然而，作為持久性有機污染物，PAH在環境中普遍存在（Haney等人，2020年；Hutzler等人， 2011年；Lao等人，2018年a、2018年b；Whitehead等人，2011年），偶爾也會作為污染物出現在消費品中，特別是那些含有炭黑或填充油的消費品（Alawi等人，2018年）。巴奇等人，2017 年；福爾加多·德·盧塞納等人， 2018 年）。當多環芳烴與皮膚接觸時，它們可以通過角質層（s.c.）擴散進入活性表皮，從而具有生物利用性。以及真皮層（巴茨，2018年；巴茨等人，2016年；西蒙等人，2023年b）。
皮膚滲透的研究可以通過體內或體外進行。體內研究存在將人類或動物暴露于有害物質和可避免風險的缺點。因此，涉及成熟的弗蘭茲擴散池（FDC）檢測的體外研究仍然是皮膚滲透研究的重要支柱（弗蘭茲，1975；吳等人，2010）。FDC提供了一個簡單的設置，其中目標物質通常嵌入或溶解在基質中，然后涂在皮膚或皮膚模型上。下面的受體室填充了水基流體，以模擬皮下層，并為完全滲透的物質提供儲存庫。在指定的時間段后，物質在皮膚內的分布及其在受體室中的濃度提供了有關皮膚滲透性的見解。
FDC（皮膚滲透）測試的金標準是人類皮膚。然而，人類皮膚并非總是容易獲取，因為它必須來自整形手術患者的捐贈（巴茨等人，2016年；哈格瓦爾等人，2021年）或尸體（埃利森等人，2020年，2021年）。合成或實驗室培養的皮膚模型是研究中越來越常用的替代品（萊莫恩等人，2021年；吳等人，2010年），但在監管背景下，它們尚未被推薦用于皮膚滲透研究（經合組織，2011年）。豬皮是人類皮膚最常見的替代品，因為它與人類皮膚具有關鍵特性。因此，豬皮在滲透相關參數（如滯后時間和擴散或分配系數）方面往往能提供相當的結果（格斯特爾等人，2016年；赫肯內等人， 2006年；羅特等人，2017年；SCCS，2010年）。此外，豬皮的獲取相對容易（霍普夫等人，2020年）。然而，人類皮膚和豬皮之間仍然存在差異（邱英等人，2019年）。研究表明，豬皮對某些物質的滲透性比人類皮膚更高（巴貝羅和弗拉斯奇，2009年；羅特等人， 2017年）。目前尚未有關于PAH（多環芳烴）在人類皮膚和豬皮滲透的全面比較報告。
有人認為，高分子量（M）的多環芳烴（五個或更多環：大分子量的多環芳烴）通過皮膚的滲透率和通量低于低分子量的多環芳烴（兩到三個環：小分子量的多環芳烴，Moody 等人，2011 年；Sartorelli 等人，1998 年、1999 年、2001 年）。然而，這些研究要么依賴于小樣本量（n ≤2)），要么涉及非人類皮膚，要么僅報告受體液中的多環芳烴濃度，因此缺乏關于個體皮膚內分布特征的信息。
在此，我們匯集了來自一組 24 種不同環數（2.5 - 6 環，M =152 - 302 克/摩爾，支持信息（SI）A 中的表 A1 和圖 A1）的經皮應用的 PAH 的幾種 FDC 檢測的數據。人類皮膚和豬皮在乙腈中的 PAH 溶液中孵育 24 小時。豬皮另外在不同的孵育時間（2 小時、4 小時、16 小時、48 小時）下進行孵育，以深入了解遷移動力學。隨后，對處理后的皮膚樣本的五層上部皮膚進行膠帶剝落，分別從剩余皮膚和受體液中分析其 PAH 含量。通過氣相色譜串聯質譜法（GC-MS/MS）進行定量分析。最后，將 PAH 在皮膚層中的分布與其對數辛醇-水分配系數（logP）相關聯。

02   方 法
此處呈現的數據是對與 FDC 檢測同時進行的質量控制的匯編，旨在研究與皮膚有可預見的接觸的消費品中皮膚多環芳烴（PAH）的滲透情況（Bartsch 等人，2016 年）。應用于皮膚樣本的每種 PAH 在乙腈中的濃度設定為 1000 納克/毫升。所使用的方法以及所應用的設備和化學品在前一項研究中已有發表。以下簡要總結該方法以清晰明了。
2.1  皮膚
人類皮膚取自柏林夏里特醫院的整形手術，源自女性腹部。進行滲透的提議對人類皮膚樣本的研究經過了獨立倫理委員會（柏林倫理委員會Charit′e，編號：EA2/090/14，2014 年 7 月 22 日）的審查和批準。側豬皮來自 VION 食品有限公司（德國佩勒貝格），并冰鎮交付。未燙傷的皮膚取自不會用于食品生產的死亡豬。兩種皮膚類型均在? 20℃下儲存，直至使用。
2.2  Franz擴散池測定法
Franz擴散池由一個用于將目標物質應用于基質中的供體腔和一個受體腔組成（推薦使用華溶TD-12AT PLUS透皮擴散系統）。受體腔填充有液體，并由水循環系統包裹，以保持皮膚處于恒定溫度。皮膚或皮膚模型放置在受體腔上，并通過供體腔蓋用夾具固定。到達受體液體的物質可被視為具有生物利用性。在本研究中，受體腔的溫度保持在33℃，這相當于皮膚表面平均溫度為32-35℃（Lee等，2019）。受體腔填充有等滲鹽水（9克/升氯化鈉），這被認為是皮下體液的良好近似值（Hoorn，2017）。
皮膚用皮膚切割機切成300微米厚，放置在受體腔室上。將捐贈帽固定在皮膚上，形成1.76平方厘米的暴露區域。根據經濟合作與發展組織（OECD，2004）的指南428，測量跨表皮水分流失（TEWL）以確保皮膚的完整性。如果皮膚樣本的TEWL大于先前通過驗證實驗確認的特定皮膚類型的平均TEWL的30%，則將該皮膚樣本從研究中排除（Bartsch等，2016）。將含有24種多環芳烴（PAH）的溶液（1000納克/毫升，具體列表見SI A的表A1）50微升涂在皮膚上（相當于28納克/平方厘米的真皮劑量），并在指定的時間間隔（2-48小時，表1）內進行孵育。對于陰性對照，應用50微升純乙腈。
在指定的孵育時間后，所有樣本都添加了內標（選定的氘化多環芳烴，將分析物與內標關聯：SI A的表A1）。用生理鹽水（9 g/l氯化鈉）沖洗供體室，然后將皮膚從組件上剝離，用五條膠帶條剝離，然后將它們合并。一條膠帶條被證明可以去除一層皮膚（Simon等，2023a），因此，將五個上層皮膚層一起分析。使用乙腈提取膠帶條，然后用正己烷再提取。這種雙重提取有助于最小化由從膠帶上提取粘附物引起的基質效應。剩余的皮膚使用乙酸乙酯提取，受體液經過固相萃取（反相C18），然后用二氯甲烷洗脫多環芳烴。所有獲得的提取物然后在氮氣流下濃縮，重新溶解在乙腈中，并通過氣相色譜-質譜/質譜法分析其多環芳烴含量。關于測量程序的更多細節在先前的出版物中提供（Bartsch等，2016）。這得出了三個部位的 PAH 濃度：（i）上皮皮膚（源自五條膠帶），（ii）剩余皮膚，（iii）受體液。

表 1　每種皮膚類型和每種孵育時間下進行的弗蘭茲擴散細胞試驗的重復次數（n）

2.3  數據分析
數據使用統計編程語言R（版本4.2.2）進行分析。數據進行了夏皮羅-威爾克正態性檢驗。如果數據不符合正態分布，則使用格魯布異常值檢驗進行異常值檢測。如果檢測結果為陽性，則異常值將被刪除。從凈化數據集中計算出每種PAH、皮膚類型、分區和孵育時間的平均值和標準偏差。所有統計檢驗的結果總結在SI B（表1和表2）中。基于每種PAH穿透皮膚的量（包括所有分區，包括受體液體的總和），計算出PAH在每個分區的分布比例。
方程（1）被用于擬合數據，并突出兩個變量 y 和 x 之間的關系，其中 u 和 w 是回歸參數：

03   結果與討論
在皮膚滲透研究中，我們將一系列廣泛的多環芳烴從乙腈遷移到人類皮膚及其最常見的皮膚替代物之一（豬皮）中的遷移情況進行了比較（SCCS，2010；西蒙和邁巴赫，2000）。此外，我們將多環芳烴在豬皮上孵育不同時間，以產生每種研究多環芳烴的動力學特征。在本研究中，最小且最不親脂的多環芳烴是芘并芘（M = 152 g/mol，logP = 4.0，盧等人，2008）和芘并芘（M = 154 g/mol，logP = 3.9，盧等人，2008），最大且最親脂的多環芳烴是二苯并芘（M = 302 g/mol，logP = 7.2-7.3， PubChem，2023b，c，d，e；美國環保署，2012）。所有24種研究多環芳烴的全面列表見表A1和圖A1（SI A）。對于研究的多環芳烴，logP和M呈線性關系（圖A2和方程（A.1），SI A）。包含每種多環芳烴在每個孵育時間對兩個物種和所有分室的量化質量、數量和比例的數據總結在SI B的Sheet 3中。
在歐盟（歐洲共同體，2023 年），對于長期或反復短期皮膚接觸的消費產品，多環芳烴（PAH）含量的監管限值為 1 毫克/千克（玩具為 0. 5 毫克/千克）。然而，過去在某些消費產品中測量到的數值要高得多，高達約 50 - 270 毫克/千克（Bartsch 等人，2017 年；BVL，2017 年）。當這些產品與皮膚接觸時，預計會出現本研究中添加的 PAH 劑量（28 納克/平方厘米）范圍內的皮膚暴露（例如，皮膚接觸 24 小時后，含有 166 毫克/千克 B[a]P 的錘子手柄釋放了 102 納克/平方厘米的這種 PAH， Bartsch 等人，2016 年）。在不同的暴露場景中，某些特定人群，如消防員，可能會經皮膚接觸到更高含量的空氣borne PAH（4 至 1200 納克/平方厘米，Sousa 等人，2022 年）。
先前的研究表明，高濃度的多種多環芳烴以及相當復雜的基質作為應用介質（Bourgart 等人，2019 年；Hopf 等人，2018 年）既能降低多環芳烴的皮膚滲透率。然而，在本研究中，應用劑量分別比上述研究低 50 倍（Bourgart 等人，2019 年）和 5000 倍（Hopf 等人，2018 年），并且多環芳烴是以溶劑基溶液的形式應用，而非復雜的混合物。在此，我們研究了其在不同皮膚部位的相對分布。因此，在接下來的章節中，我們的討論基于相對量，這些相對量是針對每種滲透入皮膚的多環芳烴的總量進行標準化的。這也使得在不同部位對單個多環芳烴進行比較更加容易。此外，它還彌補了在皮膚和受體部位檢測到的多環芳烴的回收率與應用于皮膚的總量相比偶爾出現的相對較大偏差（補充信息 B 的表 3）。
3.1  經皮涂抹的多環芳烴在人類和豬皮膚中的分布
多環芳烴的親脂性越強，就越容易被皮膚吸收（見圖1，24小時孵育時間；其他孵育時間在豬皮中的情況見圖A.3，SI A）。在之前的研究中，當比較苯并芘和二苯并芘的皮膚遷移時，觀察到了類似的效果（Bartsch等，2016）。由于所研究的多環芳烴的logP和M呈線性相關，這些結果也可以同樣地解釋為摩爾質量。然而，由于在本研究中，超過所研究的最重多環芳烴M的親水性物質被證明能夠有效地滲透皮膚（Ellison等，2020，2021；Potts和Guy，1992），親脂性可能是更重要的因素。
我們最近證明，表征多環芳烴在角鯊烷和皮膚中分布的分配系數取決于各自多環芳烴的M和logP值（Simon 等人，2023b）。高脂溶性多環芳烴更容易從這個脂溶性基質中分配到皮膚中（logP=15.6，ACD/Labs，2021）。因此，對于乙腈（logP=?0.3，PubChem，2023a），由于更脂溶性化合物應該更容易從這個極性溶劑中分配到疏水性皮膚中，預計會有類似但更顯著的趨勢。同樣，對于水性基質和皮膚，一系列廣泛的脂溶性（logP>3）物質的分配系數與 logP呈正相關（SI A中的圖A.4）。關于多環芳烴滲透到更深皮膚層，應用介質的影響應該不太相關。然而，在孵育期間，乙腈可能已經穿透到皮膚中，有選擇性地增強了較小、不太脂溶性多環芳烴的滲透。
由于土壤是一個相對親脂的基質（雷卡爾等人，1988 年），親脂性更強的多環芳烴應該也能被土壤更有效地保留。

圖 1.多環芳烴在各室（角質層（s.c.）、剩余皮膚）中的分布比例與 24 小時孵育時間后皮膚（角質層（s.c.）、剩余皮膚）和受體液中發現的總量，與辛醇 - 水分配系數（logP）的對數相比。均值±偏差。曲線表示擬合到方程（1）的數據。a) 人類皮膚（n = 13）。b) 豬皮（n = 9）。對于豬皮的其他孵育時間（n = 3），請參閱補充信息 A 中的圖 A3。
在s.c./活表皮邊界層處。實驗證實了這一點：孵育24小時后，低logP的多環芳烴滲透到整個活真皮，主要在FDC的受體液中檢測到。豬皮的這種效果比人的皮膚更強。相反，大的多環芳烴在研究的時間框架內沒有完全滲透皮膚，也沒有在受體液體中發現。包括溶解度增強劑（如白蛋白）的替代受體溶液可能更好地溶解這些高親脂性多環芳烴。盡管如此，當受體溶液中含有50 mg/ml BSA時，即使在6μ g/cm2范圍內非常高的皮膚劑量下，也只觀察到少量滲透（Simon等人，2023b）。由于活的表皮和真皮層的相當含水的層位于s.c以下，親脂物質仍然需要克服這一屏障。
通過將方程（1）擬合到數據上（圖1；參數：SI B，表4），可以近似計算出每種多環芳烴在上皮、剩余皮膚和受體液中的分布比例。當繪制這些曲線時，它們有助于直觀地展示出各個分布比例對logP的依賴關系。此外，它們還表明，多環芳烴在每個分布比例中在logP約為6.0時趨于一個極限。對于較大的多環芳烴，無論生物物種（豬或人類）如何，分布比例不再進一步變化。一個可能的解釋是，更親脂性的多環芳烴更傾向于分配到親脂性更強的上皮中，而不是親水性更強的表皮下。另一個假設是，它們與皮膚蛋白的相互作用存在差異。如果較大的多環芳烴對這些蛋白質的親和力更高，它們也會被更牢固地保留。原則上，其他物理化學性質也可能調節滲透過程。例如，研究表明，分子體積與多環芳烴通過皮膚的通量有關，盡管在我們的數據中未發現統計學上顯著的差異（Alalaiwe等， 2020）。
在剩余皮膚中檢測到的部分，對于人類或豬皮的 logP 值而言，都沒有實質性的變化。所應用的膠帶剝落程序僅涉及五條膠帶，從剩余皮膚中僅去除五個上層皮膚角質層（Simon 等人，2023a），因此該部分包含大部分皮膚角質層以及皮膚角質層/活表皮邊界層。因此，在這個部分中發現了穿透活表皮的中小型多環芳烴以及主要保留在皮膚角質層中的大型多環芳烴。
3.2  人類皮膚和豬皮對多環芳烴滲透率的比較
人類皮膚比豬皮更能有效地保留小PAH。這反映在24小時孵育后，豬皮中受體液中小PAH的比例高于人類皮膚（圖1）。同樣，殘留皮膚中這些物質的含量也較低，平均而言，人類皮膚的含量更低。這些結果與之前對親脂性化合物的研究一致。例如，一項關于庚烷、十六烷和二甲苯（logP>3）的研究發現，這三種物質在豬皮中的滲透系數高于人類皮膚（Singh等，2002年）。
回歸曲線（方程（1）），將人類與豬皮膚中檢測到的多環芳烴相對含量的比率作為對數P的函數進行擬合，當對數P較大時，漸近地達到一個極限值0.60（圖2；數值：SI B的Sheet 5，擬合參數：Sheet 6）。因此，對于更親脂的多環芳烴，豬皮膚更能模擬人類皮膚。以前的研究表明，人類皮膚中的脂質與豬皮膚中的脂質相比，排列方式不同（正交側向排列），密度更大（六方側向排列），盡管不同脂質的摩爾比大致相等（Caussin等，2008）。這些更緊密排列的脂質可能會減緩人類皮膚中較小多環芳烴的擴散。另一方面，較大多環芳烴在兩種物種的皮膚中保留方式更相似，差異不太明顯。
我們之前測定了多環芳烴在豬皮膚中的擴散系數，對于對數P>4的多環芳烴，擴散系數相似，而萘（對數P=3.4）的擴散系數顯著更高（Simon等，2023b）。這可能暗示對數P>4時擴散機制的變化人類和豬的皮下組織中擴散速率的價值以及它們之間的更緊密關系。

圖 2.在 24 小時的孵育時間下，人類角質層中發現的多環芳烴（PAH）的相對量與豬角質層中發現量的比值，與 PAH 的辛醇 - 水分配系數（logP）的對數。均值±偏差。曲線表示擬合到方程（1）的數據。芴標準偏差的上限：1.45 。
然而，獲取皮膚樣本的解剖部位似乎對皮膚的滲透性組成沒有顯著影響，正如之前的研究表明的那樣（Khiao In 等人，2019 年）。此外，據報道，冷凍不會顯著改變人類皮膚的滲透特性（Jacques-Jamin 等人，2017 年）。相反，豬皮則受到了影響：在?20℃冷凍和儲存后，對親脂性模型物質水楊酸甲酯的滲透率比新鮮豬皮增加了多達 25%（Morin 等人，2023 年）。通過直接比較大鼠、兔子和豬皮，這一影響得到了支持，表明后者尤其容易受到冷凍的影響（Sintov 和 Greenberg，2014 年）。由于我們使用的是冷凍的皮膚樣本，這種影響可能導致觀察到的多環芳烴通過豬皮的滲透率高于人類皮膚。
3.3  多環芳烴的皮膚滲透動力學
一般來說，親脂性較差的PAH比親脂性較強的PAH滲透皮膚的速度更快。這一點從相對較短的時間內（僅2小時）在受體室檢測到的小型PAH的量相對較高可以看出，而大型PAH則在上皮中保留到48小時，并且根本不會滲透到受體液中。例如，在2小時后，從皮膚和受體室回收的芘蒽（一種小型、2.5環的PAH，圖3a）的量中，幾乎60%檢測到在受體液中，而不到20%留在上皮中。相反，在相同的孵育時間下，二苯并[a，1]芘（一種大型、6環的PAH，圖3c）在上皮中的回收率超過75%，并在4小時后穩定在約70%，而即使在48小時后，在受體液中仍未檢測到。由于在超過40小時的時間段內未檢測到分布模式的顯著變化，我們懷疑即使延長孵育時間，大型PAH也不會完全滲透皮膚。值得注意的是，這種長時間的暴露不太可能反映涉及通過皮膚接觸向消費者產品轉移PAH的真實暴露場景。然而，在研究的時間框架內，在皮下積累但不進一步深入的持久性芳香烴可能會形成一個儲庫，在后期時間點似乎有可能從該儲庫遷移到皮膚中。皮下細胞層的更新約為 14 天，這使得積累的化合物最多有兩周的時間分配到活皮膚中（米爾斯通，2004 年）。
對中等多環芳烴（如芘）的動力學分析（圖 3b）表明，2 小時后，穿透皮膚進入的芘的量中僅有約 4%到達受體液，近 70%被上層皮膚保留，28%留在剩余的皮膚中。然而，14%的受體液，其余部分在上部皮膚和剩余皮膚之間大致均勻分布。48 小時后，幾乎四分之一的多環芳烴的量遷移到受體液中。所有其他研究的多環芳烴的皮膚滲透動力學結果見圖 A.5 - A.7（SI A），并顯示出類似的趨勢。

圖 3　在不同孵育時間下，所選多環芳烴（PAH）在不同隔室中的分布比例與在豬皮和受體液中發現的總量的關系。均值±偏差。24 小時：n = 9；其他孵育時間：n = 3。a) 芘蒽（154 克/摩爾，logP = 3.92），b) 芘（202 克/摩爾，logP = 4.88）和 c) 二苯并[a，l]芘（302 克/摩爾，logP = 7.20）。對于所有其他 PAH，請參閱補充信息 A 中的圖 A5 至 A7。

04   結 論
通過涉及人類和豬皮的體外 FDC 測定，我們表明，廣泛的多環芳烴的皮膚滲透效率在很大程度上取決于 logP，因此也與 M 相關。在類似于皮膚接觸可能受多環芳烴污染的消費產品的時間框架的孵育時間內，發現小分子量和在較小程度上中等大小的多環芳烴相對較快地到達受體液（例如，在 2 - 4 小時內）。另一方面，對于高度親脂性的多環芳烴，上皮層是皮膚滲透多環芳烴最重要的屏障。這些較大的多環芳烴不會從親脂性較強的上皮層顯著分配到更具水性的活性表皮中，并且在上皮層中有效保留長達 48 小時。這在上皮層和剩余皮膚中多環芳烴的回收得到了支持，后者包含上皮層的大部分。由于在 FDC 測定中，大分子量的多環芳烴未到達受體液，因此它們大概不會轉移到體內循環中，而是隨著時間的推移，通過受污染層的脫屑最終被去除。另一方面，不能排除在皮膚中形成儲庫，并在較長時間內隨后遷移到表皮的可能性。此外，我們表明豬皮對多環芳烴的滲透性比人類皮膚更強，而對于小分子和親脂性較弱的多環芳烴，這種差異更為顯著。