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本篇文章提出了一種經(jīng)過驗證的體外釋放測試方法，用于控釋腸道外長效微球。使用利培酮微球驗證USP4法（流池法）體外釋放試驗方法。進(jìn)行了加速和實時釋放測試。加速方法明顯縮短了檢測時間，并與實時釋放曲線（樣本分析數(shù)量有限）有良好的相關(guān)性。采用加速條件進(jìn)行方法驗證（耐用性和重現(xiàn)性）。耐用性測試結(jié)果表明，微球的釋放不受流速的影響，且不受方法的微小變化(如池體裝樣方法、微球上樣量、流通池大小和玻璃珠尺寸大小)的影響。隨著溫度的微小變化（±0.5℃），影響PLGA的催化降解，釋放曲線顯現(xiàn)了顯著的差異。當(dāng)改變系統(tǒng)、設(shè)備或分析人員不影響釋放曲線，因此加速方法是可重復(fù)的。本工作確定了改進(jìn)的藥典USP 4法用于微球藥物體外釋放測試可能性。
用于治療和預(yù)防各種疾病的注射用控釋制劑的數(shù)量預(yù)計將進(jìn)一步增加，原因如下：（1）研究新發(fā)現(xiàn)的多肽和蛋白藥物不穩(wěn)定，在胃腸道中滲透性較差；（2）基因醫(yī)學(xué)正從研究轉(zhuǎn)向臨床，這些產(chǎn)品需要腸外遞送；（3）藥物靶向治療變得越來越普遍（為了避免毒副作用，將昂貴的藥物定位在作用部位，并將藥物運送至體內(nèi)其他無法到達(dá)的部位）。
注射用控釋制劑有以下幾種劑型，包括微球、脂質(zhì)體、植入劑和藥物洗脫支架。這些產(chǎn)品大多是通過皮下（SC）或肌肉（IM）途徑注射給病人，藥物在體內(nèi)的釋放時間長達(dá)幾周或幾個月時間。需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)臋z測，來確保控釋制劑的安全性和有效性。與常規(guī)劑型不同，注射劑缺乏標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)，特別是沒有一種標(biāo)準(zhǔn)方法來進(jìn)行體外釋放試驗，用于產(chǎn)品質(zhì)量的常規(guī)評估和產(chǎn)品開發(fā)中的處方優(yōu)化，以及體內(nèi)外相關(guān)性（IVIVC/R）的評估。目前使用的方法有“取樣分離法”和“透析法”，都未使用美國藥典的官方溶出釋放裝置。這使得實驗室間比較和監(jiān)管批準(zhǔn)審批困難。美國制藥科學(xué)家協(xié)會（AAPS）、國際制藥聯(lián)合會（FIP)、歐洲制藥科學(xué)家聯(lián)合會（EUFEPS）、控釋協(xié)會（CRS）、美國藥典（USP）、歐洲藥典（EP）、美國食品藥品管理局（FDA）和歐洲藥品評價機構(gòu)（EMEA）舉辦的研討會強調(diào)了指導(dǎo)控釋藥品體外釋放試驗方法的必要性，建議盡可能使用簡單的方法或?qū)⑵湫薷臑樾滦偷捏w外釋放試驗。
聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）微球已成為最有前途的注射用控釋制劑之一。自1989年以來，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了許多注射用PLGA微球產(chǎn)品。用于微球體外釋放試驗方法有“取樣分離法”、“透析法”和“流池法”。然而，體外釋放曲線因使用的檢測條件而異。因此，這些產(chǎn)品需要有標(biāo)準(zhǔn)的體外放行檢測方法，用于減少釋放曲線的變化，并使實驗室內(nèi)和實驗室間的方法轉(zhuǎn)移成為可能。
Zolnik等人開發(fā)了一種改進(jìn)的USP4法(流池法)，用于實時和加速測試條件下微球的體外釋放測試，并證明了USP4法相對于傳統(tǒng)的“樣品和分離”方法的優(yōu)勢。除了幾何尺寸和操作精度(如流量、溫度等)外，改進(jìn)的USP 4法(流池法)方法還具有以下優(yōu)點:（1）微球與釋放介質(zhì)可以分離；（2）可根據(jù)實驗需要靈活使用不同體積的釋放介質(zhì)；（3）操作方便；（4）介質(zhì)的蒸發(fā)量最小；（5）通過原位光纖實時監(jiān)測釋放過程；（6）可自動化操作。然而，需要對改良USP4法進(jìn)行驗證，以確保其適用于預(yù)期用途（例如作為微球質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)體外放行檢驗方法）。ICH-Q2A分析方法驗證指南將方法的耐用性定義為方法檢測能力不受參數(shù)微小變化的影響，并在正常使用期間提供其可靠性的指示。可通過在不同日期使用不同設(shè)備進(jìn)行體外放行檢驗，并由不同分析員進(jìn)行檢測，測定方法重現(xiàn)性。
注射PLGA微球是用于長期（數(shù)天至數(shù)月）釋放的藥物。因此，質(zhì)量控制和制劑開發(fā)需要做體外加速釋放試驗。然而，應(yīng)建立實時和加速方法之間的關(guān)系，以證明常規(guī)質(zhì)量控制檢驗中使用的檢測方法的適用性。通過在高溫或極端pH條件下增加PLGA降解（酸或堿催化的PLGA降解），可實現(xiàn)PLGA微球藥物的加速釋放。預(yù)期藥物釋放機制在加速釋放檢測期間不會發(fā)生變化，因此可在加速和實時釋放曲線之間建立理想的1:1相關(guān)性。然而，在加速試驗條件下（極端pH或溫度），釋放機制可能發(fā)生變化。這種顯示不同制劑間至少存在等級順序相關(guān)性的方法可用于質(zhì)量控制。
本文介紹了一種有代表性的控釋微球體外釋放試驗方法。使用改良的USP4（流通池）裝置開發(fā)了實時和加速釋放方法。驗證了加速方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，并考察了使用改良USP4裝置獲得的釋放曲線重現(xiàn)性關(guān)鍵方法參數(shù)。本研究使用了商業(yè)化的25mg的利培酮長效微球注射劑。
2.1 材料
PLGA 65:35(MW: 95 kDa)（伯明翰聚合物公司）；二氯甲烷、四氫呋喃（優(yōu)級純）和乙腈(色譜級)(賽默飛世爾科技公司，賓夕法尼亞州匹茲堡)；利培酮（西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司，密蘇里州圣路易斯、Tecoland公司，新澤西州愛迪生）；聚乙烯醇(PVA)(MW: 30-70kDa)、三氟乙酸（西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司，密蘇里州圣路易斯）；所有研究均使用純化水；利培酮微球長效注射劑(規(guī)格：25mg；批號：176921、168800、169941、9BA231、9BA237、8MA071、9MA575和8JA816；購自O(shè)rtho-Mcneil -Janssen制藥，康涅狄格大學(xué)學(xué)生健康服務(wù)藥房）。
2.2 方法
2.2.1 微球的制備
采用油-水(o/w)乳液萃取/蒸發(fā)技術(shù)制備了裝載利培酮的PLGA微球。將1克PLGA溶于4毫升二氯甲烷中。使用均質(zhì)器將300mg利培酮溶解在PLGA溶液中，轉(zhuǎn)速為10,000 rpm，時間為30秒。然后將該有機相緩慢添加到20毫升1% (w/v)的聚乙烯醇(PVA)水溶液中，并在10,000 rpm下均質(zhì)2分鐘。將該乳液添加到250毫升0.1% (w/v)的PVA水溶液中，在25°C下以600 rpm的速度在真空下攪拌4小時。將得到的微球過濾，用去離子水洗滌三次，真空干燥24小時。制備三份微球。
2.2.2 藥物和微球的表征
2.2.2.1 高效液相色譜法（HPLC） 使用高效液相色譜系統(tǒng)測定利培酮的濃度，紫外吸收檢測器設(shè)置為275 nm。流動相為乙腈:水:三氟乙酸(25:75:0.1%，v/v/v)。安捷倫C18色譜柱 (4.6 mm×15cm)，流速設(shè)置為1ml /min。進(jìn)樣量為30 μl。標(biāo)準(zhǔn)曲線包含預(yù)期未知(藥物)濃度的80-120% (0.1 ~ 20 μg/ml)。在0.5 ~ 20 μg/ml范圍內(nèi)測定精密度、準(zhǔn)確度和線性度。
2.2.2.2 測定利培酮的電離常數(shù)（pKa） 用玻璃電極(Fisher Scientific pH計)在25、40和45°C下電位滴定法測定利培酮的電離常數(shù)。在去離子水中制備0.001 M的利培酮溶液。用0.01 N鹽酸(HCI)滴定25 ml利培酮溶液(0.001 M)。用Henderson-Hasselbach方程計算利培酮在不同溫度下的電離常數(shù)(pKa)。所有測量都進(jìn)行了三次，結(jié)果報告為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
2.2.2.3 載藥量 將5毫克微球溶解在10ml四氫呋喃(THF)中，采用高效液相色譜法測定利培酮濃度。載藥量定義為:載藥量=(載藥量/微球重量)× 100。所有測量都進(jìn)行了三次，結(jié)果報告為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
2.2.2.4 粒度分析 使用AccuSizer 780A自稀釋顆粒粒度系統(tǒng)測定平均顆粒直徑。大約50毫克的微球分散在2毫升0.1% (w/v) PVA溶液。取200 μl分散液進(jìn)行粒度分析。所有測量都進(jìn)行了三次，結(jié)果報告為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
2.2.2.5 玻璃化轉(zhuǎn)變溫度 采用Q100型差示掃描量熱儀(DSC)分析了微球的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。樣品從-40°C加熱到100°C，冷卻到-40°C，然后以20°C/min的速度再次加熱到100°C。使用了第一個熱循環(huán)測定微球的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)。所有測量都進(jìn)行了三次，結(jié)果報告為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
2.2.2.6 分子量測定 采用凝膠滲透色譜法(GPC)與蒸發(fā)光散射探測器(ELSD) 測定微球的分子量。流動相為四氫呋喃，流速為2 ml/min，溫度40℃。將10mg微球溶解在10ml四氫呋喃(THF)中，并通過0.45 um過濾器后進(jìn)行GPC分析。使用Waters Millenium軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和分析。采用聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)(2000、900、824、400、200、110、43、18.80、17.60、6.93、2.61、0.98 kDa)進(jìn)行校正，計算其平均分子量(Mw)。所有測量都進(jìn)行了三次，結(jié)果報告為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
2.2.2.7 微球降解 將10mg空白微球和利培酮微球置于6ml的pH 7.4磷酸鹽緩沖液中。將試管保持在40和45±0.2℃的水浴中孵育。每24小時取出三個空白和利培酮裝載微球的試管，最長4天。真空干燥24小時。使用GPC監(jiān)測微球分子量變化，如第2.2.2.6節(jié)所述。
2.2.2.8 體外釋放度 使用閉環(huán)系統(tǒng)配置12mm標(biāo)準(zhǔn)小池的流池法進(jìn)行實驗。在池體（12mm池體）中填充直徑為1 mm的玻璃珠至1/3位置。稱取大約10毫克的微球，并分成質(zhì)量相等的三份。第一部分加在池體的玻璃珠上，然后蓋上一小勺的玻璃珠。剩下兩部分微球同樣的方法加樣。池體里裝滿玻璃珠直到池體上邊緣。用防靜電槍中和玻璃珠、微球和刮刀上的靜電，以方便樣品制備。250ml的 0.05 M pH 7.4磷酸鹽緩沖液（含0.1%疊氮化鈉），以8 ml/min的流速循環(huán)通過池體（裝有0.45 μm再生纖維素濾膜）。為了評價該方法的耐用性，考察了較大的流速（16 ml/min），較大的玻璃珠（直徑2.4-2.9 mm）和較大的池體（直徑22.6 mm）。此外，并使用以下方法進(jìn)行裝樣:(1)分兩部分加入微球而不是三部分；(2)微球投樣量增加50%，改變?nèi)苊絧H值為pH 6.9和7.9。流池法的溫度分別維持在37±0.1℃和45±0.1℃，用于實時測試和加速測試。在加速測試中，溶媒溫度變化范圍為45±0.5℃。釋放試驗開始前，使用USP方法(USP通論<711>)對釋放介質(zhì)進(jìn)行脫氣處理。在介質(zhì)瓶中使用氦氣噴射進(jìn)行脫氣。在適當(dāng)?shù)臅r間間隔取樣并補液，以保持漏槽條件。所有藥物釋放試驗一式三份，報告結(jié)果為平均值+標(biāo)準(zhǔn)差。
使用商業(yè)化利培酮微球(Risperdal? Consta?)在改良的USP4(流池法)儀器上進(jìn)行加速和實時體外釋放試驗。這些微球的載藥量和粒徑范圍分別為38% w/w和25-150μm。本實驗測定的微球載藥量為39.74±0.67% (w/w)。
3.1 實時和加速釋放曲線
在實時條件下(37°C)進(jìn)行的商業(yè)化利培酮微球(Risperdal? Consta?)的體外釋放表明，最初的突釋量(24小時的釋放)為1.6%，隨后是約24天的遲滯期。遲滯期之后是藥物釋放期，從第24天到第40天(圖1)。通過將溫度從37℃升高到45℃進(jìn)行體外加速釋放試驗。在加速條件下觀察到約2%的突釋(24小時釋放)。遲滯期從37°C下的約24天顯著減少到45°C下的4天。在加速條件下4天的遲滯期后是長達(dá)約7天的藥物快速釋放階段。藥物從微球釋放的總持續(xù)時間從大約40天減少到7天(圖2)。
實時和加速釋放曲線在同一時間軸上通過時間縮放(縮放因子6.5)進(jìn)行比較。如圖2所示，實時釋放曲線和加速釋放曲線經(jīng)過時間縮放后重疊在一起。縮放因子為實時和加速釋放條件下釋放度為50%時的時間比值。實時條件下釋放的分?jǐn)?shù)與加速條件下釋放的分?jǐn)?shù)之間具有良好的相關(guān)性(在有限樣本分析n = 3時)，相關(guān)系數(shù)為0.9929(圖3)。
3.2 加速條件下藥物釋放方法的耐用性評價
使用商業(yè)化利培酮微球?qū)Τ跏技铀籴尫艞l件進(jìn)行了耐用性測試。通過有意改變方法參數(shù)，評估藥物加速釋放方法的耐用性:(1)流速;(2)上樣方法;(3)流通池尺寸;(4)微球上樣量;(5)玻璃珠的大小;(6)釋放介質(zhì)pH值;(7)溫度。如圖4所示，微球體外釋放藥物不受流速(8和16 ml/min)的影響。如2.2.2.8節(jié)所述，在玻璃珠層中將微球分三等分和兩等份加入，對裝樣方式進(jìn)行了評價。結(jié)果表明池體裝樣方式的不同對微球的釋放曲線沒有影響（圖5)。如圖6所示，流通池的大小變化(直徑12mm和22.6 mm)對釋放曲線沒有影響。增加50%的微球上樣量，對釋放曲線也沒有任何影響(圖7)。玻璃珠尺寸從1mm增加至2.4–2.9mm時，釋放曲線無變化（圖8)。釋放介質(zhì)（磷酸鹽緩沖液）的pH降低0.5個單位（pH 7.4-6.9）時，觀察到釋放曲線略慢，當(dāng)pH增加0.5單位（pH 7.4-7.9）時，釋放曲線更快（圖9)。釋放溫度變化±0.5?C對微球的釋放曲線有顯著影響，如圖10所示。
3.3 利培酮PLGA微球的溫度敏感性
制備空白微球和利培酮微球（如第2.2.1節(jié)所述），以進(jìn)一步研究利培酮微球的溫度敏感性（圖10）。95 kDa（65:35共聚物比）的PLGA用于制備微球。如表1所示，市售和自制的利培酮微球特性不同。制備的利培酮微球的平均粒徑和載藥量分別約為7μm和14%（w/w），而市售微球的報告粒徑和載藥量分別為25-150 μm和38%（w/w）。市售微球的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（約48℃）高于制備的空白微球和利培酮微球（約40℃）。然而，兩種制劑（商用和制備的利培酮微球）的突釋相似（如第2.2.2.8節(jié)所述測定24小時釋放）（表1）。
從分子量隨時間的變化可以看出，與相應(yīng)的空白微球相比，制備的利培酮微球降解得更快（如圖11）。與空白微球相比，制備的利培酮微球?qū)?℃的溫差下（40℃和45℃）分子量變化也更高。
3.4 重現(xiàn)性檢測
體外釋放試驗(使用商業(yè)化利培酮微球Risperdal? Consta?)由:(1)同一分析員使用不同USP 4法系統(tǒng)進(jìn)行，(2)由不同分析員使用不同USP 4法系統(tǒng)進(jìn)行，以確定方法的重現(xiàn)性(圖12和圖13)。釋放曲線沒有變化，表明改進(jìn)的USP4法(流池法)可用于微球的體外釋放試驗。
商業(yè)化微球(Risperdal? Consta?)表現(xiàn)出較小的突釋(在前24小時約1.6%)，這可能是由于表面相關(guān)藥物的擴(kuò)散所致。在體外實時釋放實驗中觀察到較長的遲滯期(約3周)被認(rèn)為是由于聚合物侵蝕需要產(chǎn)生足夠的孔隙來促進(jìn)藥物擴(kuò)散和隨后的釋放。據(jù)報道，在滯后階段，這些微球的聚合物分子量從90 KDa變化到20 KDa。聚合物侵蝕和藥物擴(kuò)散的結(jié)合被認(rèn)為是高分子PLGA微球可能的藥物釋放機制(Zolnik et al.，2006)。因此，商業(yè)化微球(Risperdal? Consta?)的藥物釋放階段(4-6周)被認(rèn)為是由于聚合物侵蝕和藥物擴(kuò)散的結(jié)合。Ramstack等人報道，商用化利培酮微球(Risperdal? Consta?)的藥物釋放階段，聚合物分子量從20 kDa下降到小于10 kDa。
加速釋放測試顯著減少了商業(yè)化利培酮微球(Risperdal? Consta?)釋放的持續(xù)時間。實時釋放曲線(37°C)和加速釋放曲線(45°C)在時間縮放后重疊(圖2)表明，在高溫加速釋放測試中并沒有改變微球的藥物釋放機制。Zolnik等人(2006年)的工作支持了這一觀察結(jié)果，他們在高溫下進(jìn)行的加速試驗遵循侵蝕控制釋放機制，并預(yù)測了37°C下的第二階段零級釋放。
對體外加速釋放試驗方法的耐用性和重現(xiàn)性進(jìn)行驗證。耐用性研究表明，商業(yè)化利培酮微球(Risperdal? Consta?)的藥物釋放不依賴于流速變化而變化(圖4)，這表明利培酮微球加速釋放為聚合物侵蝕的控制機制。類似的結(jié)果此前也有報道，流速變化(USP4法)對高分子量(25,28和70 kDa) 地塞米松PLGA微球的釋放沒有影響，因為藥物釋放機制是聚合物侵蝕控制的。由于藥物擴(kuò)散控制釋放機制，低分子量PLGA微球(即5 kDa)觀察到流速依賴性的釋放過程(Zolnik et al.，2006)。
因為這些參數(shù)可能隨著分析員和實驗(在不同時間進(jìn)行)的變化而變化，所以考察了流通池的池體裝樣方法和微球裝樣量的微小變化。該方法對裝樣方法(分為兩個或三個部分)和裝樣量有很好的耐用性(圖5和圖7)。評估了兩種不同的流通池尺寸(即12毫米和22.6毫米直徑)，以確定在微球釋放方法中是否需要指定池體尺寸。流通池的尺寸大小對微球的釋放曲線沒有任何影響(圖6)。流通池的大小可以根據(jù)用于釋放實驗的微球的用量來選擇。直徑為1毫米的玻璃微珠通常用于USP4法中。有必要評估較大的玻璃珠是否對微球釋放有影響，因為玻璃珠的大小可以改變微球在池體中的分布(空隙體積的變化)以及微球周圍的流動模式。將玻璃珠的直徑從1mm增加到2.4-2.9mm對釋放曲線沒有影響(圖8)。直徑小于1 mm的玻璃微珠沒有被評估，因為它們可能會阻塞流通池的入口管路。在特定流速下，流通池大小的變化會影響池體內(nèi)的流體動力學(xué)。然而，如目前工作研究，這不會影響聚合物侵蝕控制微球的釋放曲線。
堿性和酸性pH均可催化PLGA降解。當(dāng)介質(zhì)的pH增加0.5個單位（pH7.4到7.9）時，觀察到釋放更快。認(rèn)為這是由于OH-離子濃度增加，PLGA降解更快。當(dāng)pH降低0.5單位（pH 7.4至6.9）時，釋放曲線較慢，因為pH 6.9接近于中性pH，因此預(yù)期PLGA降解較慢（圖9)。
微球的釋放曲線對±0.5℃溫度變化較為敏感（圖10)。體外釋放度/溶出度檢測的允許溫度誤差范圍為0.5℃（USP溶出度通則711）。然而，該溫度范圍 (±0.5℃)不適用于對溫度敏感的利培酮微球類產(chǎn)品的體外放行檢驗。因此，需要將溫度控制在±0.1℃的范圍內(nèi)，以獲得可重現(xiàn)的體外釋放曲線。
在微球包裹胺類藥物中，如硫嘧達(dá)酮，美沙酮和奎寧，觀察到胺催化的PLGA水解和隨后的更快的聚合物降解。Oster等人合成了胺修飾的支鏈PLGA，實現(xiàn)了聚合物的快速降解，用于DNA的遞送，發(fā)現(xiàn)隨著聚合物胺取代量的增加，降解速率也隨之增加。這種效應(yīng)歸因于質(zhì)子化胺基團(tuán)增加了水的吸收和酸催化降解PLGA酯鍵(Oster et al.，2004)。Maulding等解釋了硫脲酮(胺類藥物)催化PLGA降解的原因是N-酰基銨離子中間體的形成，該中間體易于通過酯鍵裂解水解(圖14)(Maulding et al.，1986)。
利培酮催化PLGA水解已被報道(Chue, 2003)。利培酮是一種胺類藥物，與哌啶氮相關(guān)的pKa為8.18(在20°C下)，如圖15所示(Jug et al.，2009)。因此，在生理條件下(pH 7.4)哌啶氮的質(zhì)子化可能是利培酮催化PLGA降解(酸催化降解)導(dǎo)致。實驗測定的利培酮pKa值（電位滴定；參見第2.2.2.2節(jié)），在25、40和45℃時分別為7.89±0.01、7.64±0.02和7.56±0.01。因此，在45℃的體外釋放條件下，預(yù)計利培酮中約59%的哌啶氮基團(tuán)質(zhì)子化（釋放介質(zhì)pH 7.4；pKa 7.56（45℃時））。因此，考慮到微球的高載藥量（38%，w/w），在體外釋放試驗條件下，利培酮顯著的催化PLGA降解是可能的。據(jù)推測，這種催化反應(yīng)的速率隨著溫度的小幅升高而增加了許多倍。為證實這一假設(shè)，使用乳劑/溶劑蒸發(fā)法制備空白和利培酮微球（參見第2.2.1節(jié)）。使用共聚物比為65:35，平均分子量（Mw）為95KDa的PLGA，其與商業(yè)化利培酮微球報告的PLGA分子量相似。但與商業(yè)微球中使用的PLGA共聚物組成(Risperdal? Consta?)是不同的。與制備的空白微球和利培酮微球(~40℃)相比，商業(yè)化利培酮微球的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)較高(約48℃)，表明商業(yè)化PLGA微球中乳酸含量較高。由表1可知，制備的微球粒徑(約7μm)和載藥量(14%，w/w)均低于市售微球。這可能是由于配方/加工條件和所用聚合物的差異造成的。商業(yè)化利培酮微球和自制利培酮微球的突釋量相似。
在40和45℃下，自制的利培酮微球的分子量明顯比空白微球下降得更快，這與前面解釋的胺催化PLGA降解的文獻(xiàn)報道一致。與空白微球(0天約為95 kDa)相比，制備的利培酮微球的初始分子量較低(0天約為~ 90 kDa)(圖11)，表明發(fā)生在微球制備過程中也發(fā)生利培酮催化PLGA降解。所制備的空白微球和利培酮微球的降解率隨著溫度(40-45℃)的升高而增加，這是由于PLGA水解具有溫度依賴性(Wu, 1995)。所制備的利培酮微球的分子量隨溫度升高5°C(40-45°C)而大幅度下降，這表面利培酮催化PLGA降解速率隨著溫度升高而顯著增加的假設(shè)(圖11)。所制備的利培酮微球在45°C時降解更快，盡管由于pKa的減少，7.64±0.02(40°C)到7.56±0.01(45°C)，質(zhì)子化基團(tuán)從大約63%(40°C)略微下降到59%(45°C)。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，催化降解速率的增加抵消了質(zhì)子化降低約4%的影響。使用自制的利培酮微球進(jìn)行降解研究(在40和45°C)，載藥量約為14% (w/w)。由于商業(yè)微球(Risperdal? Consta?)的載藥量較高(約為38%，w/w)，溫度對PLGA降解的影響預(yù)計將更加明顯。這種行為可能是商業(yè)化利培酮微球(Risperdal? Consta?)在±0.5°C的溫差下釋放曲線具有顯著差異的原因(圖10)。
使用USP4法測試時，將pH和釋放介質(zhì)溫度確定為利培酮微球體外釋放曲線可重現(xiàn)的關(guān)鍵參數(shù)。因此，應(yīng)在體外釋放試驗中精確控制這些參數(shù)。然而，pH和溫度效應(yīng)可能因包封藥物和聚合物特性（如分子量、結(jié)晶度和疏水性）而異。
除pH和溫度外，還觀察到溶解的空氣是影響體外釋放結(jié)果的關(guān)鍵因素（數(shù)據(jù)未顯示）。雖然溶出介質(zhì)的初始脫氣對速釋制劑的溶出度檢測是有用的，但釋放介質(zhì)通常在長期體外釋放檢測中又重新溶解空氣，這可能影響結(jié)果。推測微球（流通池中）捕獲到氣泡可能導(dǎo)致藥物釋放曲線變慢。體外釋放試驗期間的脫氣有助于避免這種變異性。
耐用性檢測結(jié)果有助于成功的重現(xiàn)利培酮微球的體外釋放曲線。該方法具有重現(xiàn)性，因為更換系統(tǒng)/設(shè)備或分析員不會影響釋放曲線（圖12和13）。方法驗證有助于確定改良的USP4法（流通池）作為微球體外放行檢驗標(biāo)準(zhǔn)方法的適用性。
改進(jìn)的USP4法流通池被驗證有良好的穩(wěn)健性和重現(xiàn)性，并被證明是微球體外釋放試驗的合適方法。這種方法似乎適合于適當(dāng)?shù)姆椒ㄞD(zhuǎn)移調(diào)查后可能的藥典改編。市售Risperdal?Consta?微球的加速和實時釋放曲線觀察到一對一的線性相關(guān)。該工作強調(diào)需要選擇適當(dāng)?shù)募铀贉y試條件，以便該方法在減少測試持續(xù)時間的同時能夠預(yù)測實時釋放曲線。該方法被證明是穩(wěn)健的(相對于方法參數(shù)的微小變化)和可重復(fù)性的(改變設(shè)備或分析人員對釋放剖面沒有影響)。驗證結(jié)果表明，該方法易于應(yīng)用于微球體外釋放試驗的實驗室。這項工作還提供了關(guān)于商業(yè)微球(Risperdal?Consta?)的溫度敏感性的重要信息，這是以前沒有報道過的。這些微球的溫度敏感性是由于利培酮催化PLGA降解對溫度的響應(yīng)增加。這導(dǎo)致當(dāng)測試溫度改變±0.5°C時，釋放曲線顯著不同。因此，本研究強調(diào)需要將商業(yè)微球(Risperdal Consta?)的體外釋放試驗溫度控制在±0.1°C的精度范圍內(nèi)。這種嚴(yán)格的溫度控制預(yù)計不需要其他微球體系，除非所加入的藥物與PLGA具有類似的反應(yīng)性。這種方法將有助于產(chǎn)品開發(fā);質(zhì)量保證;以及微球配方的監(jiān)管審批流程。
對改良的USP4法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性進(jìn)行了驗證，證明其為微球體外放行檢驗的適當(dāng)方法。這種方法似乎適合于進(jìn)行方法轉(zhuǎn)移。對于市售的利培酮微球的加速和實時釋放曲線，觀察到點對點的線性相關(guān)性。該工作強調(diào)需要選擇適當(dāng)?shù)募铀僭囼灄l件，以便該方法除了縮短試驗持續(xù)時間外，還可預(yù)測實時釋放曲線。證明該方法具有耐用性（相對于方法參數(shù)的微小變化）和可重現(xiàn)性（設(shè)備或分析員的變化對放行曲線無影響）。驗證結(jié)果表明，該方法在微球體外釋放試驗的實驗室中易于調(diào)整。該工作還提供了有關(guān)利培酮微球的溫度敏感性的重要信息，先前尚未報告。微球的溫度敏感性是由于溫度升高時利培酮催化PLGA降解增加。當(dāng)檢測溫度改變±0.5℃時，這導(dǎo)致釋放曲線顯著不同。因此，本研究強調(diào)需要將利培酮微球的體外釋放檢測溫度控制在±0.1℃的準(zhǔn)確度范圍內(nèi)。預(yù)計其他微球系統(tǒng)不需要進(jìn)行這種嚴(yán)格的溫度控制，除非包裹的藥物與PLGA具有相似的反應(yīng)特性。這種方法將有助于產(chǎn)品開發(fā)，質(zhì)量保證，以及微球制劑的監(jiān)管批準(zhǔn)過程。
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