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作者：陳諭園、吳松、陳麗青、張媛媛、高鐘鎬、李天磊、黃偉、楊慶云
翻譯：華溶應用中心
地拉羅司是治療成人和兒童地中海貧血引起的鐵超負荷的一線藥物。其在生物藥劑學分類系統中被分類為II類化合物，因此在制造過程中應嚴格控制其活性藥物成分 (API) 的粒度。本研究采用激光衍射法測定地拉羅司原料藥的粒度分布。我們還通過研究重要的光學參數和樣品分散條件，開發并驗證了一種準確且方便的方法。相對標準偏差值，即d (0.1)，d (0.5) 、d (0.9) 和d (4,3)，通過方法學驗證和實際樣品測量測得的值< 3%。比較了不同粒徑地拉羅司制備的幾批分散片在4種溶出介質中的溶出曲線，考察了粒徑對藥物體外溶出的影響。結果表明，地拉羅司原料藥的粒度分布顯著影響其分散片的釋放。
作為一種遺傳性疾病，地中海貧血可歸因于血紅蛋白產生紊亂，在地中海地區的人群中尤其常見。鐵過載是地中海貧血的主要癥狀之一。人體不能去除多余的鐵。因此，目前可用的鐵螯合劑，例如去鐵酮和去鐵羅司，用于處理各種疾病中的鐵過載。地拉羅司屬于三齒鐵螯合劑，其中兩個地拉羅司分子與每個鐵（Fe3+原子形成穩定的復合物（圖1A）。與其他鐵螯合劑相比，該螯合劑具有安全性和有效性方面的優勢。雖然腎毒性是地拉羅司的嚴重不良反應，但此藥廣泛用于治療成人和兒童輸血含鐵血黃素沉著癥。Deferasirox分散片（以Exjade ?上市）已于2005年被食品和藥物管理局（FDA）批準為一線療法，于2006年被歐洲藥品管理局（EMA）批準為一線療法。此外，地拉羅司于2002年3月被EMA指定為孤兒藥。
地拉羅司的活性成分是白色至灰白色結晶性粉末。該粉末易溶于二甲基甲酰胺和二甲基亞砜，微溶于甲醇，幾乎不溶于水。顆粒大小和分布差水溶性藥物直接影響其在體內的釋放和吸收及其療效。通常，小微粒具有可用于擴散的大表面，增加釋放速率。因此，在生產地拉羅司分散片時，應嚴格控制粒度分布。本品粒度的質量控制應建立準確方便的測量方法。
迄今為止，用于評估微粒尺寸的常用技術包括光學顯微鏡、沉淀、掃描電子顯微鏡 (SEM) 、篩析和激光衍射方法。光學顯微鏡的優點是可見性。然而，該方法的主要缺點是耗時的手動樣品制備。SEM具有類似的缺點，它主要用于表征微粒的內部結構和表面形態。沉降試驗時間方法長，操作復雜。雖然篩分分析因其成本低而被廣泛使用，但尺寸小于38 μm的干粉難以測量。此外，結果受到人為因素的顯著影響。
激光衍射是一種基于Mie理論和Fraunhofer近似的測量方法。該方法通過測量散射光強度的空間分布來確定粒子的尺寸和分布。激光衍射具有良好的重復性和精確性，近年來在材料科學和藥劑學研究中得到了廣泛的應用。然而，尚未報道用于測量地拉羅司活性藥物成分 (API) 的粒度和分布的可用激光衍射方法。在目前的研究中，使用激光粒度分析儀MalvernMastersizer 3000來研究地拉羅司粒度測量的關鍵影響因素。討論了尺寸測量程序的發展，并系統地驗證了最佳激光衍射方法。使用該方法準確測定了幾批API樣品的粒度和分布。用體積平均粒徑d (4,3) 表征顆粒的尺寸差異。粒度分布由d (0.1) 、d (0.5) 和d (0.9) 表征。此外，在4種溶出介質中比較了不同粒徑地拉羅司制備的幾批分散片的溶出特性，研究了粒徑對藥物體外溶出的影響。
2.1材料
大量地拉羅司原料藥（批號20180201、20180202、20180203和20190523）在我們的合成實驗室（中國北京）生產。地拉羅司分散片（批號20180622、20180629和20191209）也在我們的制藥實驗室（中國北京）生產。商業分散片（批號SP168）購自諾華公司制藥公司SteinAg（瑞士巴塞爾）。地拉羅司參比物質從美國藥典獲得。聚山梨酯80 (Tween-80) 由阿法埃莎 (中國天津)提供。阿拉丁(中國上海)提供約10%壬基酚乙氧基化物 (NP-40) 水溶液。質量審計標準顆粒從摩文分析有限公司購買。（英國伍斯特郡馬爾文）。高效液相色譜 (HPLC) 級乙腈 (ACN) 和甲醇 (MEOH) 來自西格瑪奧德里奇公司 (St.用于制備流動相.用MilliQ系統純化去離子水（Millipors,比勒利卡.MA,美國），自制，采用0.22μm過濾膜過濾。除非另有說明，其他化學品均為分析級。
2.2儀器儀表
使用激光衍射粒度分析儀（粒度分析儀 3000，馬爾文儀器有限公司.，伍斯特郡英國）用600 mL懸浮燒杯測量地拉羅克斯原料藥的粒度分布。采用以下優化參數進行測量：顆粒折射率，1.699；顆粒吸收指數，0.1；中等折射率，1.330；樣品測量持續時間，5s；背景測量持續時間，5s；測量次數，3次；和測量之間的延遲，5s。將測量裝置的攪拌器速度設定為2500 r/min以防止樣品懸浮液的沉降。在樣品測量之間，將分散單元排出并用去離子水洗滌。使用弗勞恩霍夫模型、通用分析模式和假設不規則粒子形狀，使用馬爾文馬斯特西策3000軟件（版本3.40）分析馬斯特西策原始數據。
使用自動溶出儀 (推薦使用華溶DS-1206AT全自動取樣溶出系統) 和TU-1810 DPC紫外 (UV) -可見分光光度計 (Perview，China，China) 測試地拉羅司分散片的溶出曲線。在285納米波長下測量吸光度。
安捷倫1260液相色譜系統，配有分光光度二極管陣列檢測器。美國加利福尼亞州圣克拉拉)用于測定溶解度。Inertsil ? ODS-3柱（150 mm×3.0 mm，3um粒徑；GL科學公司，日本)在15 ℃的烘箱溫度下操作以進行分離。流動相A是磷酸二氫鉀的20 mM水溶液。
預先調節至pH值2.5，流動相B為乙腈。流動相A和B以48∶52 (v/v) 的比例混合。流速保持在0.5 ml/min，注射體積為10ul，并且在245納米進行紫外檢測。
2.3粒度分析
稱取樣品（25mg地拉羅司），置于50ml錐形瓶中。隨后，加入40 ml分散劑（0.1% NP-40在水中），并充分振搖混合物。將混合物在室溫下超聲處理8分鐘，然后用分散劑稀釋體積以獲得懸浮液。向預充有去離子水的600 ml燒杯中加入約2ml的樣品體積。添加另外的樣品直到達到10%和15%之間的遮蔽水平。分散單元中的攪拌器速度設定為2500 r/min，內部超聲處理40%。每個樣品至少進行三次測量。
2.4溶解度測定
制備濃度為0.06%、0.1%、0.3%、0.6%和0.9%的100 mL的NP-40水溶液。5個地拉羅司API（批號20180201）稱量約25mg/劑，并置于不同濃度的NP-40水溶液中。通過超聲處理將樣品完全懸浮并用0.22um膜過濾。此后，將隨后的濾液用作樣品溶液。準確稱取約25mg地拉羅司參比物質并轉移至25- ml容量瓶中。用10 ml甲醇填充燒瓶并超聲處理約15min以溶解參比物質。然后用50%乙腈-水稀釋至刻度。隨后，用50%乙腈-水將1.0 ml該溶液稀釋至50ml，并且搖勻，得到標準溶液。對樣品和標準溶液進行HPLC分析。使用等式 (1) 計算不同濃度下地拉羅司在NP-40水溶液中的溶解度：
其中Ax和As分別是來自樣品和標準溶液的峰值響應；ms是地拉羅司標準的加權質量；Vs是標準溶液的稀釋倍數。
2.5溶出介質的制備方法
簡言之，0.5%吐溫20水溶液，0.5%使用Tween-20 pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液、0.5% Tween-20 pH 4.5醋酸鹽緩沖溶液和0.5% Tween-20 pH 1.0鹽酸溶液作為溶解介質。這些培養基制備如下。
對于0.5%吐溫- 20水溶液：稱取5g吐溫20，溶于1000 ml水中。
對于0.5% Tween-20 pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液：稱取6.8045克磷酸二氫鉀和0.896克氫氧化鈉，溶于適量水中。然后用水將溶液稀釋至1000 ml。隨后，加入5g吐溫20并完全溶解。
對于0.5% Tween-20 pH 4.5醋酸鹽緩沖溶液：稱取2.99g乙酸鈉，向其中加入1.6 ml冰醋酸，用水稀釋至1000 ml。隨后，加入5g吐溫- 20并完全溶解。
對于0.5% Tween-20 pH 1.0鹽酸溶液：用水將9ml鹽酸稀釋至1000 ml。然后，加入5g吐溫20并完全溶解。
2.6溶出曲線測定方法
采用中國藥典溶出試驗的第二種方法，取上述溶出介質測量溶出曲線。中位體積為900 ml。轉速為50r/min，中值溫度為37±0.5℃。在5min、10min、15min、20min、30min、45min和60min取約5min的溶出介質。此后，補充5 ml的溶解介質。精確地，將4ml該溶液與4ml乙腈混合并用作樣品溶液。準確稱取一份地拉羅司參比物質，并以25ug/ml乙腈稀釋。精確地，將5ml該溶液與5ml溶解介質混合并用作標準溶液。還進行了紫外-可見分光光度法。使用等式 (2) 計算不同時間點的累積釋放百分比，并繪制溶解曲線：
式中Cn和CnI分別為采樣的實測值和校正值;U和V分別為總采樣體積和采樣體積。 采用相似因子(f2)比較不同粒徑的去甲惡靈分散片與參比分散片的溶出度分布:
其中n為數據點數;Rt和Tt分別為參比制劑和被測制劑在特定時間點的溶解百分比。如果f2≥50，則認為溶出度分布相似。
3.1分散劑的選擇
地拉羅司易溶于二甲基甲酰胺和二甲基亞砜，但不溶于水。從分散劑選擇的原則出發，綜合考慮經濟、無毒、環保等方面的優勢，將水作為測定地拉羅司粒徑的分散介質。然而，地拉羅司是疏水性的，并且在與水接觸或漂浮在液體表面上時表現出明顯的聚集傾向。表面活性劑可用于“濕潤”地拉羅司晶體并減少聚集。通過添加適當的分散劑，隨著表面張力降低，親水性增加得到加強。采用外部超聲攪拌，有效地減少了懸浮液的聚集，提高了懸浮液的穩定性。該方法能夠均勻穩定地通過光學檢測單元并獲得精確的粒徑和分布結果。
本研究考察了0.1% Tween-80和0.1% NP-40兩種分散劑水溶液對樣品的分散性。結果表明，以0.1%吐溫-80水溶液為分散劑時，樣品的分散穩定性較差。樣品粉末表現出聚集和沉淀現象。多次并行測量的精度較差。以0.1%的NP-40水溶液為分散劑時，樣品的穩定性較好。超聲處理后樣品仍能均勻分散。測量結果令人滿意，具有良好的精度。因此，采用0.1%的NP-40水溶液作為分散劑，測量地拉羅司的粒徑和分布。
3.2分散劑濃度的研究
制備不同濃度的NP-40水溶液，例如0.06%、0.1%、0.3%、0.6%和0.9%。稱取每劑約25 mg的5個地拉羅司API，并置于不同濃度的NP-40水溶液中。此后，測定樣品溶液的粒度和溶解度。每個樣品至少進行三次測量。利用d (0.1) 、d (0.5) 、d (0.9) 和d (4,3) 的平均值研究分散劑濃度對測量結果的影響；相對標準偏差（RSD %）；加權殘差作為調查指標（補充A）。還進行了HPLC（如補充數據中附錄B所示）。計算了不同濃度的NP-40水溶液中地拉羅司的溶解度。表1提供了測量結果。
表1中的結果表明，基于差的分散均勻性和RSD %值，當分散劑濃度<0.1%時，樣品溶液不完全分散。隨著NP-40濃度的逐漸增加，地拉羅司顆粒尺寸的測量結果趨于穩定。當分散劑中的濃度達到0.3%時，地拉羅司的溶解度顯著增加，導致小尺寸的嚴重損失。因此，綜合考慮了0.1% NP-40。
3.3光學參數的研究
顆粒尺寸測量的重要光學參數包括介質折射率、顆粒折射率、顆粒吸收指數和遮蔽度。介質為水，其折射率為1.330。地拉羅司的折光率和吸光率分別為1.669和0.1。遮蔽也是一個關鍵的光學參數，可以直接反映樣品量。如果遮蔽太高或太低，則由于顆粒的多次散射和測量結果的差的代表性，顆粒尺寸和樣品分布將受到影響。在本研究中，我們研究了不同遮蔽對顆粒尺寸測量的影響。結果見表2和圖1B（補充C）。表和圖顯示遮蔽在10% -20%范圍內。測量結果、精度和殘差均令人滿意。
3.4樣品分散條件的研究
粒度測量的重要光學參數是介質折射率和顆粒。Deferasirox API由于其尺寸小，易于在水中聚集。合適的攪拌器速度和超聲處理方法可以避免顆粒沉降，并允許具有不同粒徑的顆粒以相同速度通過檢測池。A Mastersizer 3000粒度分析儀（英國伍斯特郡Malvern儀器有限公司）配有槳式攪拌器和內部超聲輔助分散裝置。設備的瓦數可以調整到10個等級。在本研究中，設置不同的攪拌器速度（500 – 3500 r/min）和超聲強度（0% – 100%）進行研究。計算d (0.1) 、d (0.5) 、d (0.9) 、d (4,3) 、RSD %和殘差的平均值。表2、圖1C和1D提供了測量結果（如補充數據附錄D所示）。
結果表明，攪拌速度對粒徑分布有明顯的影響。當攪拌器速度大于3000 r/min時，產生氣泡，導致結果不準確。攪拌速度為500～2500 r/min時，無明顯差異。在攪拌器速度為2500 r/min時獲得最佳值。
此外，結果表明，必須采用超聲處理來幫助分散顆粒。當超聲強度在10% ~ 60%范圍內時，未觀察到對測量結果的顯著影響。但是當超聲處理強度大于80%時，測量結果的精度較差。這種現象可能是由于聲處理產生的機械能，其可以破壞原始粒子。因此，選擇40%的超聲強度作為最佳超聲強度。
考慮到固定的40%聲處理強度沒有發生變化，我們研究了不同的聲處理時間（0-120秒）對測量結果的影響。結果表明，超聲處理時間對顆粒尺寸沒有顯著影響。最佳超聲處理時間設定為60s。
3.5方法驗證
在準確度、精密度和重復性方面進行了方法驗證。測定各試樣，計數d (0.1)、d(0.5)、d (0.9)、d (4，3)的結果。計算平均值、RSD %和加權殘差%值。表3提供了結果（如補充數據附錄E所示）。
采用已知的d (0.1)、d (0.5)和d (0.9) 標準粒子重復三次驗證儀器和方法。根據ISO13320-1（第6.4節），d（0.1）和d（0.9）的觀測值和理論值的偏差應小于5%，d（0.5）的偏差應小于3%。如果顆粒尺寸< 10 um，則最大偏差應加倍。平行測量的RSD %值< 3%。結果表明，儀器測量的精度符合要求。
重復測量樣品10次。10倍測量的RSD %值< 3%。根據儀器參數和方法制備了5個樣品。每個樣品重復測量三次。測得的RSD %值結果< 3%。這些結果表明，該方法具有良好的精密度和重復性。
3.6樣品粒度測量結果
根據儀器參數和方法制備了四批地拉羅司API樣品用于粒度測量。表4顯示了結果（補充F）。地拉羅司原料藥的粒度和分布的測量結果在兩個批次（即20180201和20180203）之間幾乎沒有差異。平均粒徑d(4,3) 約為4μm。批次20180202的粒度相對較大，d（4，3）的平均粒度約為7um。相比之下，批次20190523較小，d值約為2um（4.3）。RSD值< 5%。
3.7原料藥粒度與制劑溶出曲線的相關性
對于具有不同粒度的三批地拉羅司原料藥（批號20180201、20180202和20190523），參考列出的參比藥物（Exjade?）的配制和技術。制備三個批次（批號20180622、20180629和20191209）的地拉羅司分散片，并將其溶出曲線與列出的參比藥物（Exjade ?，批號SP168）在四種溶解介質中。結果表明，地拉羅司原料藥的粒徑和分布對片劑的體外溶出釋放有顯著影響。使用大粒徑API制備的分散片的溶出速率和累積釋放百分比低于使用小粒徑API制備的片劑的溶出速率和累積釋放百分比，特別是在酸性溶出介質中。在pH 1.0的溶出介質中，分散片20180629（原料藥的平均粒徑為7um）、20180622（原料藥的平均粒徑為4μm）和20191209（原料藥的平均粒徑為2um）5min的溶出速率分別為11.72%、18.18%和分別為21.97%、16.10%、22.12%和26.51%。15 min后溶出曲線趨于平緩，45 min的累積釋放百分率分別為18.59%、25.23%和28.40%。在pH 6.8的溶解介質中，可分散的批次20180622、20180629和20191209的片劑基本一致，15min后超過85%。然而，批次20191209中分散片的溶出速率相對較快，即15分鐘后溶出速率為97.57%。相比之下，批次20180629僅為89.82%。批次20180622（原料藥的平均粒徑為4μm）分散片的溶出曲線與參比列出的藥物（Exjade ?，批號SP168）。相似因子f2的值>50。圖2給出了具體溶出實驗結果（如補充數據附錄G所示）。
本文采用Mastersizer 3000激光衍射粒度分析儀對地拉羅司原料藥的粒度和分布進行了系統的研究。建立了激光衍射法，通過考察重要的光學參數、樣品分散條件、分散劑的種類和濃度等關鍵因素，確定了地拉羅司原料藥的粒徑。該方法也得到驗證。該方法快速、準確、操作簡單，重復性好。比較了不同粒徑地拉羅司在4種溶出介質中制備的幾批分散片的溶出曲線，考察了粒徑對藥物體外溶出的影響。實驗數據顯示活性成分在酸性環境中的粒度對地拉羅司分散片的釋放產生顯著影響。
因此，應建立準確、有效的原料藥粒度測定方法，并嚴格控制原料藥粒度，保證藥效。
在這個案例研究中，我們提出激光衍射作為評估地拉羅克斯粒子的尺寸和分布的有用工具。這種方法有助于深入理解顆粒特性和藥物釋放之間的關系。激光衍射提供了尋找最佳粒度分布以確定適當工藝參數的基礎。該方法彌補了原藥物測定方法的不足，提高了藥物質量控制，進一步保證了效率。采用激光衍射作為分析技術在地拉羅司分散片生產過程中，采用設計質量方法。該方法適用于相對直接的質量控制。
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