時(shí)間:
作者：劉芳伶、范詩雨、周 群等
目的：流通池模擬難溶性藥物米拉貝隆緩釋制劑的溶出，建立米拉貝隆體內(nèi)和體外的相關(guān)性（IVIVC）模型，開發(fā)具有預(yù)測能力的體外溶出方法。
方法：Loo-Riegelman法對三種不同釋放速率制劑的體內(nèi)血藥濃度進(jìn)行反卷積分獲得相應(yīng)的累積吸收百分?jǐn)?shù)（Fabs%），建立體外溶出目標(biāo)曲線。以純水為試驗(yàn)介質(zhì)，流速4.0mL·min-1的試驗(yàn)條件下進(jìn)行制劑R（貝坦利?，50mg）和制劑T1、T2（50mg）的溶出試驗(yàn)，通過高效液相色譜法測定溶出度，梯形面積法獲得制劑的累積溶出百分?jǐn)?shù)（Fdiss%）。
結(jié)果：立了米拉貝隆緩釋制劑體內(nèi)累積吸收與體外溶出度之間的A級 IVIVC（回歸系數(shù)大于0.9）, 制劑的外部預(yù)測誤差在規(guī)定范圍內(nèi)。
結(jié)論：研究建立的米拉貝隆緩釋制劑IVIVC模型經(jīng)驗(yàn)證具有較好的預(yù)測能力，該方法擁有的良好區(qū)分力及線性模型也可以為質(zhì)量控。
膀胱過度活動癥（OAB）是一種以夜尿、尿失禁、尿急、尿頻為主要癥狀的泌尿系統(tǒng)疾病。OAB不僅會嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，而且也會給患者帶來巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。一項(xiàng)來自歐洲4國的調(diào)查結(jié)果顯示，過去40年OAB男女發(fā)病率分別為13.4% 和14.6%。在美國，每年用于OAB的治療花費(fèi)接近十億美元。米拉貝隆是由日本安斯泰來 ( Astellas) 公司研發(fā)的首個(gè)用于治療OAB的選擇性β3腎上腺素受體激動劑。
美國食品藥品管理局（FDA）指南推薦將體內(nèi)外相關(guān)性（in vivo-in vitro correlation, IVIVC）作為預(yù)測性數(shù)學(xué)模型，用于描述劑型的體外特性（通常是藥物溶解或釋放的速率或程度）與相關(guān)的體內(nèi)反應(yīng)（如血漿藥物濃度或藥物吸收量）之間的關(guān)系。20世紀(jì)80至90年代，美國藥典（USP）/ FDA的研討會報(bào)告確定了IVIVC的發(fā)展目標(biāo)為“使用溶出度試驗(yàn)替代生物等效性試驗(yàn)，并幫助制定溶出度規(guī)范”。米拉貝隆緩釋片于2017年在中國批準(zhǔn)上市，近5年間，國內(nèi)僅一家企業(yè)研發(fā)的米拉貝隆緩釋片通過一致性評價(jià)，且國內(nèi)關(guān)于其溶出度/釋放度及IVIVC方面的報(bào)道較少，已有的相關(guān)研究主要考察自研制劑與參比制劑在四條曲線下釋放行為一致性。由于米拉貝隆屬于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（biopharmaceutical classification, BCS）Ⅱ類藥，低溶解度是藥物在體內(nèi)吸收的限制因素，因此該制劑適合開展制劑IVIVC研究，建立具有預(yù)測能力的體外溶出方法。
本研究旨在利用流通池法對米拉貝隆緩釋片進(jìn)行IVIVC研究，用以區(qū)分空腹?fàn)顟B(tài)下制劑間的溶出行為，建立米拉貝隆的A級IVIVC，并評估模型對于藥動學(xué)參數(shù)的預(yù)測誤差是否在標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi)，這可能對監(jiān)管機(jī)構(gòu)的監(jiān)管審查、評價(jià)制劑間的差異提供幫助。
2.1 儀器
流通池（推薦使用華溶DS-7CP流池法溶出系統(tǒng)）；1260 型高效液相色譜儀（Agilent）；BSA224S-CW 型萬分之一電子天平 ；Vortex-5 型可調(diào)式微型渦旋混合器（上海嘉鵬科技有限公司）；TGL16M 型高速冷凍離心機(jī)；Eso-S15HUVF 型超純水儀（湖南啟沁環(huán)?？萍加邢薰荆?；FE28 型pH 計(jì) （ 梅特勒 - 托利多國際貿(mào)易 ( 上海 ) 有限公司 ）；KS-600VDE/3 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。
2.2 試藥
米拉貝隆緩釋片（原研制劑，商品名：貝坦利 ?， 制 劑 R)， 生 產(chǎn) 廠 家：Avara PharmaceuticalTechnologies Inc.，規(guī)格：50mg，批號：20K2349；米拉貝隆緩釋片（制劑T1），批號：210906，規(guī)格：50mg，由國內(nèi)某藥企提供；米拉貝隆緩釋片（制劑T2），批號：20211011，規(guī)格：50mg，由國內(nèi)某藥企提供；乙腈（色譜純，MREDA）；甲醇（色譜純，MREDA）；乙酸銨（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為純化水。
2.3 溶出儀試驗(yàn)裝置
全自動流通池溶出儀主要包含溶出主機(jī)、計(jì)算機(jī)精密測控系統(tǒng)、自動取樣系統(tǒng)、恒溫水浴等組成。溶出主機(jī)主要包含6個(gè)流通池，其直徑約2 cm，高約10 cm，流通池內(nèi)搭載內(nèi)循環(huán)，以控制介質(zhì)的渦旋流動，兩端均配備由二氧化硅過濾墊片組成的過濾系統(tǒng)，模擬藥物的吸收。試驗(yàn)過程中，恒溫溶出介質(zhì)通過操作控制系統(tǒng)集成的精密泵以精確穩(wěn)定的流速從流通池底部進(jìn)入，樣品溶出液經(jīng)過濾系統(tǒng)進(jìn)入自動取樣裝置，待至取樣時(shí)間點(diǎn)可自動取樣。將藥物投放入流通池，計(jì)算機(jī)精密測控系統(tǒng)設(shè)置相應(yīng)參數(shù)，即可開始試驗(yàn)。
3.1 體內(nèi)研究
3.1.1?制劑R與制劑T1的生物等效性試驗(yàn)
采用單中心、隨機(jī)、開放、兩制劑、三周期、三序列、部分重復(fù)交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)。委托?？谑腥嗣襻t(yī)院開展試驗(yàn)，并經(jīng)其生物醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn) 審批件編號：2018-( 倫審 )-144，志愿者對研究知情同意，并自愿簽署知情同意書，30例體檢狀況良好的健康志愿者入組該試驗(yàn)。每周期志愿者分別服用米拉貝隆緩釋制劑T1或制劑R1片。分別在給藥前0h和給藥后0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，6，8，10，12，24，48，72，96h采集血樣4mL，并保存在含氟化鈉的肝素鈉抗凝真空管中。離心（4℃、1700×g、10min）分離血漿后保存至 -80℃超低溫冰箱。采用經(jīng)驗(yàn)證的LC-MS/MS法測定血漿樣本中米拉貝隆的濃度。
3.1.2?制劑R與制劑T2的生物等效性試驗(yàn)
采用單中心、隨機(jī)、開放、兩制劑、兩周期的自身交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)。委托長沙泰和醫(yī)院開展試驗(yàn)，并經(jīng)其倫理委員會批準(zhǔn) 審批件編號：(2021)第(53)號，志愿者確定為體檢狀況良好的健康男性和女性，對研究知情同意，并自愿簽署知情同意書。16例志愿者每周期按隨機(jī)表單次空腹口服米拉貝隆緩釋制劑T2或制劑R1片。分別于給藥前0h及給藥后 0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，6，8，10，12，24，48，72，96 h分別采集靜脈血約4mL并保存在提前預(yù)冷30min的 EDTA-K2+氟化鈉抗凝管中。離心（4℃、1 700×g、10min）分離血漿后保存至-80℃超低溫冰箱。采用經(jīng)驗(yàn)證的LC-MS/MS法測定血漿樣本中米拉貝隆的濃度。
3.1.3?藥動學(xué)數(shù)據(jù)分析
人體單劑量口服米拉貝隆緩釋制劑R、制劑T1、制劑T2后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖1，各項(xiàng)參數(shù)比值（ratio）的90%CI 見表1、表2。在 R與T1對比研究中，R與T1的Cmax、AUC0-t和AUC0-∞3個(gè)參數(shù)幾何均值比（geometricmean ratio，GMR）的90%CI均在80%~125%范圍內(nèi)，相較制劑R，制劑T1的吸收速度稍慢、吸收程度稍低。在R與T2對比研究中，所有藥動學(xué)參數(shù)GMR的90%CI均超出了80%~125%范圍，提示制劑T2與制劑R未實(shí)現(xiàn)生物等效，制劑T2較制劑R的吸收速度更快、吸收程度更高。
3.1.4?目標(biāo)曲線的確立
采用WinNonlin8.2 軟件中的PK模塊對米拉貝隆制劑R的人體血漿藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行房室模型擬合，根據(jù)其AIC值評估為二室模型。利用Loo-Riegelman法對米拉貝隆的兩項(xiàng)生物等效性（BE）研究中制劑R、制劑T1和制劑 T2的血漿藥物濃度進(jìn)行反卷積，解析體內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)的累積吸收百分?jǐn)?shù)（Fabs%），即吸收曲線：
式中，Ct為t時(shí)間點(diǎn)的血漿藥物濃度，(Xp)t為 t 時(shí)間周邊室的藥物量，Vc為中央室的表觀分布容積，K10 為藥物從中央室消除的一級速率常數(shù)（由文獻(xiàn)報(bào)告的靜脈數(shù)據(jù)中求算獲得）。
如圖1-C所示，三制劑在6~8h間吸收完全，制劑T2累積吸收高于制劑R，與體內(nèi)BE結(jié)果相吻合；制劑T1與制劑R的累積吸收接近，說明經(jīng)L-R計(jì)算出的三條累積吸收曲線可作為體外溶出的目標(biāo)曲線。
3.2 體外研究
3.2.1?制劑R與制劑T1和T2溶出試驗(yàn)
在選擇純水為溶出介質(zhì)、流速為4 mL·min-1、1.5 h自然溶脹后以 100mL·min-1 循環(huán) 6.5 h 的溶出條件下，分別于30，60，90，120，150，180，210，240，300，360，480 min 時(shí)間點(diǎn)采集樣本。利用 HPLC法在柱溫30℃，Agilent TC-C18 柱（4.6 mm×150mm，5μm，Agilent，USA），以乙腈 -50 mmol·L-1 的醋酸銨（3∶7，v/v）為流動相，流速為 1 mL·min-1，檢測波長為248nm的條件下測定樣品各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的濃度。
3.2.2?溶出數(shù)據(jù)處理及分析
本研究采用的流通池法屬于開環(huán)系統(tǒng)，經(jīng)開環(huán)系統(tǒng)溶出所得到米拉貝隆的濃度 - 時(shí)間曲線為濃度 - 時(shí)間曲線，經(jīng)數(shù)值積分轉(zhuǎn)換為累積溶出百分?jǐn)?shù) - 時(shí)間曲線，其公式 如下：
式中，F(xiàn)diss% 為累積溶出百分?jǐn)?shù)，n 為體外溶
圖1 米拉貝隆緩釋制劑R、制劑T1和制劑T2的體內(nèi)血藥濃度-時(shí)間曲線及體內(nèi)吸收分?jǐn)?shù)-時(shí)間曲線
注：A.口服制劑R與制劑T1后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線（n=30，Mean±SD）；B.口服制劑R與制劑T2后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線（n=16，Mean±SD）；C.三制劑（R、T1和T2）的體外溶出目標(biāo)曲線
表1 空腹條件下米拉貝隆緩釋制劑R與制劑T1幾何均值比的90%可信區(qū)間（n=30）
表2 空腹條件下米拉貝隆緩釋制劑R與制劑T2幾何均值比的90%可信區(qū)間（n=16）
出試驗(yàn)取樣點(diǎn)數(shù)量，ti為0~n中的第i個(gè)整數(shù)時(shí)間點(diǎn)，ti-1為0~n中的第i-1個(gè)整數(shù)時(shí)間點(diǎn)，Ci為ti時(shí)間點(diǎn)濃度，Ci-1為ti-1時(shí)間點(diǎn)濃度，F(xiàn)lowrate為溶出介質(zhì)流速，dosage為制劑規(guī)格。
以制劑R溶出曲線作為對照，微分溶出曲線（圖2-A）表明，制劑R與制劑T1在整個(gè)試驗(yàn)過程中溶出速度變化趨勢基本相似，2h后溶出過程較為平穩(wěn)，實(shí)現(xiàn)了藥物從制劑中的緩慢釋放，展現(xiàn)出緩釋制劑的緩釋特性，而制劑T2在3h濃度達(dá)最大值時(shí)高出制劑R最大濃度的29%，溶出行為較制劑R差異大。同時(shí)，累積溶出分?jǐn)?shù)-時(shí)間曲線（圖2-B）表現(xiàn)出制劑間良好的區(qū)分力，制劑T2在180min后累積溶出分?jǐn)?shù)高出制劑R約5%~10%，溶出速度快。三制劑在此溶出方法下所表現(xiàn)出的快慢趨勢與目標(biāo)曲線趨勢一致。
圖2 米拉貝隆緩釋制劑R、制劑T1和制劑T2的濃度-時(shí)間曲線（A）及體外累積溶出百分?jǐn)?shù)-時(shí)間曲線（B）（n=4，Mean±SD）
3.3 體內(nèi)外相樣性研究
3.3.1?IVIVC模型的建立
將任意兩種不同速率制劑的體外累積溶出分?jǐn)?shù)（Fdiss%，mean）作為自變量， 經(jīng)解析獲得的體內(nèi)累積吸收分?jǐn)?shù)（Fabs%，mean）作為因變量， 利用最小二乘法進(jìn)行線性回歸建立A級IVIVC（見 圖 3-A、圖3-B、 圖3-C）。制劑R與制劑T2建立的IVIVC方程為：Fabs%=0.9463Fdiss%+0.2451，R2=0.9906（P=0.940＞ 0.05）。制劑T1與制劑T2建立的 IVIVC方程為 Fabs%=0.9381Fdiss%+1.5570，R2=0.9879（P=0.931＞ 0.05）。制劑R與制劑T1建立的IVIVC 方程為：Fabs%=0.9681Fdiss%+0.4491，R2=0.9842（P=0.991＞ 0.05）。采用SPSS21軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)算95%CI。結(jié)果表明：單個(gè)制劑由兩兩制劑建立的 IVIVC 模型方程所獲得的 Fabs% 與目標(biāo) Fabs%間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。為了驗(yàn)證已經(jīng)建立的A級IVIVC，將比較三種制劑 Fabs% 實(shí)測值與預(yù)測值之間的差異，結(jié)果見圖3-D、圖3-E、圖 3-F。所有模型的回歸系數(shù)均大于 0.9，擬合優(yōu)度接近于1，滿足點(diǎn)對點(diǎn)的A級水平相關(guān)。制劑R與制劑T1和 T2間的預(yù)測吸收曲線與實(shí)測吸收曲線幾乎相吻合，表明建立的A級IVIVC具有良好的預(yù)測能力。
3.3.2?IVIVC模型預(yù)測能力評價(jià)
BCSⅡ類藥物體內(nèi)藥物的吸收主要受限于藥物的溶出，認(rèn)為藥物進(jìn)入胃腸道內(nèi)的溶出過程等價(jià)于吸收過程 。根據(jù)FDA指南，單個(gè)制劑的藥動學(xué)參數(shù)預(yù)測誤差小于10%時(shí)，表明模型的預(yù)測能力較好。依據(jù)制劑R與制劑T2所建立的IVIVC模型獲得制劑T1相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)預(yù)測的Fabs%，再利用如下卷積分公式獲得制劑T1各時(shí)間點(diǎn)藥動學(xué)參數(shù)：
圖3 制劑R（制劑T1和制劑T2）預(yù)測吸收曲線與目標(biāo)曲線對IVIVC模型驗(yàn)證
式中，CT為T時(shí)間點(diǎn)預(yù)測血藥濃度，CT-1為T-1時(shí)間點(diǎn)濃度，(XA)T為T時(shí)間藥物吸收的總量，(XP)T-1為T-1時(shí)間周邊室的藥量，Vc為中央室表觀分布容積，K12與K21為藥物在中央室與周邊室間轉(zhuǎn)運(yùn)的一級速率常數(shù)（由靜脈數(shù)據(jù)求算獲得），Kel 為藥物從中央室消除的一級速率常數(shù)；△t為t時(shí)間與t-1時(shí)間的差值。如表3所示，制劑T1的 Cmax、AUC0-48h 的預(yù)測誤差（PE）分別為0.46%，4.05%，預(yù)測誤差小于10%，IVIVC模型符合要求。
在米拉貝隆緩釋制劑的溶出行為研究中，倪冬勝的溶解度實(shí)驗(yàn)表明米拉貝隆的溶解度呈pH 依賴，隨pH 增加而減小，0.1 mol·L-1的鹽酸條件下，原研制劑可在2h 內(nèi)溶出約40%，與目標(biāo)曲線中前120min 的累積吸收百分率未超過10% 的結(jié)果有一定差距，由此推測米拉貝隆可能主要不在胃部釋放。此外，歐洲公開審評資料也顯示米拉貝隆主要釋放部位在腸道，于是本研究選擇了pH較高的介質(zhì)。并在進(jìn)行一系列條件摸索實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)在純水條件下，制劑R顯示出良好的相關(guān)性，這一結(jié)果也與文獻(xiàn)一致。故本研究選擇純水作為釋放介質(zhì)。米拉貝隆緩釋制劑是一種親水凝膠骨架型緩釋制劑，主要由親水性聚合物控制藥物的釋放。文獻(xiàn)表明，基質(zhì)吸水后會在基體表面形成凝膠層，折疊的聚合物逐漸打開，凝膠層逐步溶蝕，一般情況下，藥物主要通過聚合物溶脹和侵蝕的方式實(shí)現(xiàn)藥物的緩慢釋放。據(jù)此估計(jì)該制劑前期可能存在吸水溶脹的過程，所以本研究在經(jīng)時(shí)8h 試驗(yàn)過程中先進(jìn)行了1.5h無循環(huán)的自然溶脹過程。試驗(yàn)結(jié)果顯示在此條件下，制劑R 的累積溶出曲線整體呈現(xiàn)先慢后快的趨勢，可與解析出的目標(biāo)曲線相吻合，表明該方法下體外溶出曲線可良好地反映出藥物在體內(nèi)的藥動學(xué)過程。米拉貝隆屬于BCSⅡ類藥物，以流通池為溶出裝置，難溶性藥物的漏槽問題可在持續(xù)更換新鮮介質(zhì)的過程中得到解決。開環(huán)式流通池序貫性模擬胃腸道的液體流動狀態(tài)，可真實(shí)客觀反映藥物在體內(nèi)的溶出行為。生物等效評價(jià)是以R與T1的藥動學(xué)參數(shù)的幾何均值比的90%CI落在 80%~125%范圍內(nèi)為標(biāo)準(zhǔn)。本研究因客觀條件限制，兩項(xiàng)研究分別在不同的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行，所獲得的藥動學(xué)參數(shù)有一定的差異。在模型能力評價(jià)時(shí)采用比值比較，一定程度上可減小誤差，故本研究選擇對制劑T1的AUC與Cmax的預(yù)測ratio值與實(shí)測ratio值進(jìn)行比較。本研究中，建立的米拉貝隆緩釋片溶出方法可以實(shí)現(xiàn)A級相關(guān)性，可以顯著區(qū)分米拉貝隆緩釋片不同制劑間的溶出能力差異。該方法可以為米拉貝隆緩釋片的制劑開發(fā)、處方優(yōu)化提供有力支持。
略
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