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翻譯：華溶應(yīng)用中心
審核：工業(yè)藥劑發(fā)燒友
Doxil?是FDA批準(zhǔn)的一種復(fù)雜靜脈注射多柔比星（DOX）脂質(zhì)體制劑。對(duì)于多柔比星脂質(zhì)體仿制藥，分析DOX的釋放曲線對(duì)于質(zhì)量控制和可比性研究非常重要。然而，尚無(wú)可靠的多柔比星脂質(zhì)體標(biāo)準(zhǔn)藥物釋放試驗(yàn)。在本研究中，我們闡述了一種基于USP-4裝置的分析方法，能夠根據(jù)釋放曲線區(qū)分DOX脂質(zhì)體制劑。在37℃的生理?xiàng)l件下，脂質(zhì)體的DOX釋放有限，從而阻礙了測(cè)定方法的建立。向釋放介質(zhì)中添加NH4HCO3有助于DOX釋放，這與添加的鹽濃度成比例，但這會(huì)導(dǎo)致釋放的藥物在流池法裝置中沉淀。在釋放介質(zhì)中加入羥丙基環(huán)糊精 (HP-CD) 可避免DOX沉淀。我們通過(guò)改變HP-CD濃度、試驗(yàn)溫度和試驗(yàn)樣品濃度等參數(shù)，優(yōu)化了DOX釋放的條件。優(yōu)化的釋放介質(zhì)包括：100mM NH4HCO3、75mM 2-（N-嗎啉代）乙磺酸（MES）和5%（w/v）HP-CD、5%（w/v）蔗糖、0.02%（w/v）NaN3（pH6）。在45℃下進(jìn)行藥物釋放試驗(yàn)，優(yōu)化的釋放試驗(yàn)可以區(qū)分不同處方、不同理化性質(zhì)以及通過(guò)不同生產(chǎn)工藝制備的DOX脂質(zhì)體制劑，這表明，該分析方法可用于比較DOX仿制藥與創(chuàng)新藥Doxil?的DOX釋放。
Doxil?是一種多柔比星脂質(zhì)體制劑，最初于1995年獲得FDA批準(zhǔn)，用于治療不同的惡性腫瘤，如艾滋病相關(guān)的卡波西肉瘤、復(fù)發(fā)性卵巢癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌和多發(fā)性骨髓瘤。Doxil?由美國(guó)強(qiáng)生公司(J&J) 銷售，于2010年失去專利保護(hù)。Doxil?生產(chǎn)高度復(fù)雜，涉及多個(gè)工藝，包括形成多層載體、擠出形成單層脂質(zhì)體、將多柔比星主動(dòng)載入脂質(zhì)體、緩沖液交換/純化、無(wú)菌過(guò)濾和瓶裝。由于產(chǎn)品的復(fù)雜性，該產(chǎn)品的仿制藥發(fā)展受到限制。2013年，由Sun Pharma（印度）生產(chǎn)的第一款參照Doxil?的仿制藥鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射液（如Doxil?）被美國(guó)FDA批準(zhǔn)進(jìn)口。多項(xiàng)分析測(cè)試以評(píng)估Doxil?及其仿制藥的理化等效性。FDA關(guān)于多柔比星脂質(zhì)體注射液仿制開發(fā)的個(gè)藥指南，強(qiáng)調(diào)體外泄漏測(cè)試“以支持在一系列生理?xiàng)l件下沒(méi)有不受控制的泄漏并向腫瘤部位細(xì)胞遞送等效藥物”。與可獲得藥典標(biāo)準(zhǔn)釋放試驗(yàn)的常規(guī)劑型不同，對(duì)于復(fù)雜脂質(zhì)體產(chǎn)品（如Doxil?），目前尚無(wú)藥典標(biāo)準(zhǔn)釋放試驗(yàn)，因此難以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間對(duì)比和脂質(zhì)體仿制藥的開發(fā)。因此，非常需要開發(fā)用于檢測(cè)Doxil?等復(fù)雜脂質(zhì)體制劑藥物泄漏的標(biāo)準(zhǔn)釋放試驗(yàn)。
流池法溶出儀近期已用于微粒和脂質(zhì)體制劑的釋放研究，結(jié)果令人鼓舞。因此，我們的目標(biāo)是開發(fā)多柔比星脂質(zhì)體的USP-4體外釋放方法。與傳統(tǒng)的釋放試驗(yàn)(例如透析袋和“取樣和分離”方法）相比，流池法釋放試驗(yàn)用于多柔比星脂質(zhì)體的優(yōu)點(diǎn)包括：(a)使用標(biāo)準(zhǔn)流池法溶出裝置；(b)易于調(diào)節(jié)釋放試驗(yàn)的不同參數(shù)(如溫度、流速和檢測(cè)波長(zhǎng))的能力；(c)在線UV檢測(cè)器連續(xù)自動(dòng)檢測(cè)多柔比星的釋放，無(wú)需取樣。總體而言，這些優(yōu)勢(shì)有助于建立穩(wěn)健的釋放試驗(yàn)，該試驗(yàn)受操作誤差的影響較小，并且可在多柔比星脂質(zhì)體產(chǎn)品生產(chǎn)商之間輕松轉(zhuǎn)移。
在當(dāng)前研究中，我們開發(fā)了流池法多柔比星脂質(zhì)體釋放試驗(yàn)，能夠區(qū)分不同脂質(zhì)體組成以及相同組成但通過(guò)不同工藝制備的制劑。在加速條件下，當(dāng)超過(guò)70%的藥物在24小時(shí)內(nèi)釋放時(shí)，已建立的流池法釋放試驗(yàn)評(píng)估了多柔比星的滲漏。通過(guò)優(yōu)化樣品與釋放介質(zhì)的比例、溫度、組成（如緩沖液組分）、氨離子加入量以及多柔比星受體環(huán)糊精的加入量，建立了測(cè)定方法。該方法可用于評(píng)估批與批產(chǎn)品的變異性、在生產(chǎn)工藝或設(shè)備變更后產(chǎn)品質(zhì)量一致性測(cè)試，并為仿制藥處方設(shè)計(jì)提供有用的反饋。它可以在未來(lái)用于潛在建立這些制劑的體外釋放行為與體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)之間的相關(guān)性。
2.1 化學(xué)品和試劑
多柔比星購(gòu)自SHJNJ PharmaTech（中國(guó)上海）和LC實(shí)驗(yàn)室（Woburn，MA）。脂質(zhì)組分：氫化大豆磷脂酰膽堿 (HSPC)；1-棕櫚酰基-2-油酰基-Sn-甘油-3-磷酸膽堿 (POPC)；1,2-二硬脂酰-Sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-氨基（聚乙二醇）-2000 銨鹽（DSPE-PEG2000）購(gòu)自Lipoid（紐約），膽固醇購(gòu)自AvantiPolar Lipids（Alabaster）。Doxil?是從密歇根大學(xué)醫(yī)院藥房購(gòu)買。β-環(huán)糊精（β-CD）和羥丙基環(huán)糊精（HP-CD）由Roquette Pharma贈(zèng)送。此外，HP-CD、β-CD和β-CD購(gòu)自SHJNJ Pharmatech（中國(guó)上海）。NH4HCO3從Sigma購(gòu)買。Float-a-lyzer?（截留分子量為10-300kDa）透析管購(gòu)自Spectrum Laboratories。蔗糖購(gòu)自Fluka。所有其他試劑均為分析級(jí)，從Sigma購(gòu)買。為確保定量分析和釋放試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，本研究中使用的所有緩沖液在使用前立即新鮮制備。
2.2 方法
2.2.1 多柔比星脂質(zhì)體的制備
將HSPC、膽固醇和DSPE-PEG2000以3:1:1的重量比（表I）溶解在1mL乙醇（EtOH）中，制備脂質(zhì)溶液。對(duì)于POPC -脂質(zhì)體制備，用等量POPC取代HSPC（表I）。將混合物加熱至65℃，直至所有固體完全溶解。通過(guò)向硫酸銨溶液中加入脂質(zhì)形成多層脂質(zhì)體（MLVs）（脂質(zhì)加成法）。具體而言，將脂質(zhì)/乙醇溶液倒入65℃攪拌的0.25M 硫酸銨溶液（L-DOXp）中，或高壓注入65℃攪拌的0.25M 硫酸銨溶液（L-DOXi）中，并在相同溫度下攪拌十分鐘，然后擠出。隨后以相同的方式處理MLVs以制備L-DOX。簡(jiǎn)言之，將Lipex擠出機(jī)（Northern Lipids, Burnaby, BC, CA)加熱至65℃，并在添加MLVs之前用0.25M 硫酸銨溶液沖洗。在擠出機(jī)中加熱MLVs 1分鐘后，壓力增加，直到出口管保持恒定流量。在室溫下，通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射（DLS, ZetaSizer 3000HSa）測(cè)量，重復(fù)擠出大約六次，直到脂質(zhì)體平均直徑在85-90nm之間且多分散度（PDI）小于0.1。H-DOX通過(guò)與L-DOXp相同的方式形成MLVs，然后使用微射流機(jī)（(Microfluidics M-110P, Microfluidics, Westwood, MA）進(jìn)行高壓均質(zhì)化，特別是在10000-15000psi下進(jìn)行兩次均質(zhì)化。通過(guò)透析法（4℃）在5 mM HEPES，10% w/v蔗糖（pH 6.5）條件下將脂質(zhì)體從硫酸銨中分離。
為了將多柔比星裝入脂質(zhì)體中，將鹽酸多柔比星（DOX?HCl）粉末以10mg DOX?HCl/mL的濃度溶解在5 mM HEPES，10% w/v蔗糖（pH 6.5）中，然后以0.125 g DOX/g脂質(zhì)的比例加入脂質(zhì)體。將混懸液混合并60℃加熱1小時(shí)，然后在冰水中冷卻至少15分鐘。未載入的多柔比星（DOX）通過(guò)對(duì)組氨酸1.55g/L、蔗糖94g/L（pH6.5）透析（4℃）從L-DOX中分離。所得脂質(zhì)體制劑通過(guò)0.2μm注射器過(guò)濾器(聚醚砜)過(guò)濾，稀釋至2.0mg DOX?HCl/mL，并在4℃下儲(chǔ)存直至使用。
2.2.2 多柔比星脂質(zhì)體的分析
采用HPLC法測(cè)定了不同脂質(zhì)體制劑中DOX的最終濃度。在HPLC樣品制備中，用990μL甲醇加入10μL多柔比星脂質(zhì)體液相小瓶進(jìn)行稀釋。渦旋混合以破壞脂質(zhì)體并溶解脂質(zhì)體組分。配有等度泵和紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀（Agilent 1100）進(jìn)行分析。Zorbax eclipse XDB-C8柱（4.6 ? 150 mm, 5μm）用于分離并配備了C18反相鍵合硅膠柱（KJO-4282）和Cartridges C-8（AJO-4290），在254nm處檢測(cè)DOX。流動(dòng)相包括0.1% v/v三氟乙酸(TFA)水溶液(A)和0.1% v/v TFA甲醇溶液(B)。流動(dòng)相以1.0 mL/min的流速在12分鐘內(nèi)以40%至100%流動(dòng)相B輸送，柱溫30℃，進(jìn)樣體積為10μL。
使用等度泵、紫外可見檢測(cè)器和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）HPLC（Agilent 1100）對(duì)膽固醇、磷脂和溶血素-PC濃度進(jìn)行了分析。Zorbax eclipse XDB-C8柱（4.6 ? 150 mm, 5μm）用于分離，并配備了C18反相鍵合硅膠柱（KJO-4282）和Cartridges C-8（AJO-4290）。使用紫外-可見光檢測(cè)器在205nm處檢測(cè)膽固醇，通過(guò)ELSD分析磷脂，將其設(shè)定為以下條件：蒸發(fā)器溫度為50℃，霧化器溫度為88℃，氮?dú)鈿怏w流速為1.0 L/min，光電倍增管為10，平滑度為5。高效液相色譜泵程序由以下條件組成：流動(dòng)相為0.1% TFA水溶液（A）和0.1% TFA甲醇溶液（B），在91% B下等度洗脫，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積為20μL，柱溫50℃；運(yùn)行時(shí)間30分鐘。以HSPC的mol%報(bào)告溶菌素-PC含量，定量限為HSPC的0.2mol%。使用標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽測(cè)定法分析脂質(zhì)體中的HSPC和PEG-DSPE含量。
使用MalvernInstruments ZetaSizer 3000HSa，通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定了室溫下的平均粒徑和多分散性，Zeta平均值在表I中報(bào)告。
2.2.3 透析裝置膜的選擇
在流池法溶出儀（推薦使用華溶DS-7CP PLUS流池法溶出系統(tǒng)）上裝有8-300kDa截留分子量（MWCO）的Float-a-lyzer?檢測(cè)透析管對(duì)多柔比星游離藥釋放的影響。簡(jiǎn)言之，將1.6 ml濃度為2mg/ml的游離多柔比星貯備液（在10% w/v蔗糖和10mg組氨酸/鹽酸中，pH 6.5）置于透析管中并放入流通池池體中，并使用78.4 ml 10mM組氨酸-氫氯化物（His/HCl）、5%蔗糖和0.02%NaN3（pH 6.5）作為釋放介質(zhì)（釋放介質(zhì)總體積為80ml，釋放介質(zhì)中的最終多柔比星濃度（CDOX）為40μg/ml）。流速和運(yùn)行溫度分別設(shè)定為16ml/min和37℃。一式三份測(cè)定釋放度，結(jié)果報(bào)告為平均值± SEM。
2.2.4 DOX脂質(zhì)體流池法釋放試驗(yàn)的建立
使用流池法溶出儀（推薦使用華溶DS-7CP PLUS流池法溶出系統(tǒng)）檢測(cè)多柔比星的釋放。簡(jiǎn)言之，將含有1.6 mL多柔比星脂質(zhì)體樣品（0.5、1和2 mg/ml濃度的L-DOX）置于透析管中，然后放入流通池池體中。每個(gè)池體使用78.4 mL的釋放介質(zhì)。將介質(zhì)以16 ml/min的閉環(huán)系統(tǒng)灌注。
考察了釋放介質(zhì)溫度、DOX濃度和釋放介質(zhì)組成對(duì)脂質(zhì)體釋放性能的影響，試驗(yàn)建立階段在37℃、45℃和55℃下進(jìn)行釋放研究，并使用45℃的溫度選擇其他試驗(yàn)參數(shù)。在總釋放介質(zhì)中以10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml的最終濃度進(jìn)行釋放試驗(yàn)，相當(dāng)于向透析管中添加1.6 mL 0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml的DOX脂質(zhì)體溶液。還考察以下因素對(duì)釋放的影響：HP-CD (1.5%、5%和20% w/v)；β-CD(1.5% w/v)和γ-CD(1.5%和5% w/v)。釋放介質(zhì)中的NH4+濃度變化為0，25，50和100 mM。除非另有說(shuō)明，釋放介質(zhì)中含有75 mM 2-（N-嗎啉代）乙磺酸以控制pH和0.02%NaN3作為防腐劑。釋放介質(zhì)的初始pH為6，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)pH6可誘導(dǎo)約50%的DOX累積釋放，這足夠根據(jù)中試研究區(qū)分不同處方。在釋放實(shí)驗(yàn)之前制備新鮮釋放介質(zhì)。
在方法開發(fā)階段，將等量游離多柔比星溶液直接置于釋放介質(zhì)中作為對(duì)照，以模擬多柔比星從脂質(zhì)體制劑中完全釋放，并監(jiān)測(cè)釋放的多柔比星在釋放期間UV吸收的任何變化。
釋放的累積百分比：
其中，脂質(zhì)體制劑的CDOX是在特定時(shí)間點(diǎn)從脂質(zhì)體釋放到釋放介質(zhì)中的多柔比星的檢測(cè)濃度，游離多柔比星對(duì)照的CDOX是在相同時(shí)間點(diǎn)的游離多柔比星的檢測(cè)濃度。在所有條件下重復(fù)測(cè)定釋放度，結(jié)果報(bào)告為平均值±SEM。
2.2.5 常規(guī)釋放試驗(yàn)
常規(guī)釋放試驗(yàn)用于研究沒(méi)有特氟龍流通池體和管的情況下DOX的釋放。簡(jiǎn)言之，將0.8 mL脂質(zhì)體制劑（CDOX=2mg/ml）置于300kDa 透析管中，隨后放入含有39.2 mL釋放介質(zhì)的50ml離心管中，總釋放介質(zhì)體積為40ml，總介質(zhì)中的最終CDOX為40μg/ml。將離心管置于轉(zhuǎn)速為320rpm/min的軌道振蕩器上，并在37℃下孵育。使用等量游離多柔比星溶液作為對(duì)照。在設(shè)定時(shí)間點(diǎn)，抽取150μL釋放介質(zhì)樣品，用酶標(biāo)儀在480nm紫外線檢測(cè)，并替換為等量的新鮮釋放介質(zhì)。使用早期公式計(jì)算DOX釋放的累積百分比。
2.2.6 各種脂質(zhì)體制劑DOX釋放的最終分析和檢測(cè)
最終優(yōu)化的USP-4釋放試驗(yàn)條件要求如下:(1)480 nm紫外檢測(cè);(2)截留300kda的Float-a-lyzer?透析管;(3)每次檢測(cè)，將0.4 mL 2mg /mL DOX脂質(zhì)體制劑與1.2 mL釋放介質(zhì)混合，在透析管中加入共1.6 mL稀釋的脂質(zhì)體溶液(0.5 mg/mL);(4)釋放介質(zhì)78.4 mL(總介質(zhì)濃度為10 ug/mL DOX);(5)釋放介質(zhì)由5% w/v HP-CD、100 mM NH4HCO3、75 mM MES、0.02% NaN3和5% w/v蔗糖(pH 6)(簡(jiǎn)稱5% HP-CD碳酸氫銨、MES、NaN3、蔗糖(AMNS))組成;(6)流速16 mL/min;(7) 溫度45℃。
對(duì)各種DOX脂質(zhì)體制劑進(jìn)行了重復(fù)三次分析，并繪制了平均累積釋放量和SEM圖。通過(guò)f2試驗(yàn)，使用以下公式評(píng)估不同處方的DOX釋放曲線之間的相似性或差異：
其中，n是時(shí)間點(diǎn)的數(shù)量，Rt是在時(shí)間t(t > 0)的參比批次的累積釋放值，Tt是測(cè)試批次在時(shí)間t(t > 0)的累積釋放值。所有時(shí)間點(diǎn)的累積釋放值（n=24）用于計(jì)算f2。相似系數(shù)f2 ≥50被認(rèn)為與參比處方相似。
為了確定每天的變異性，在三個(gè)不同的日期分析相同的樣品；每天重復(fù)三次。報(bào)告了7小時(shí)和24小時(shí)多柔比星累積釋放的平均值、SEM和方差。還計(jì)算并報(bào)告了f2。
3.1 多柔比星脂質(zhì)體的制備與表征
制備了組成與Doxil?相同的脂質(zhì)體制劑，并對(duì)其進(jìn)行了表征，用于流池法藥物釋放試驗(yàn)開發(fā)。在表I中總結(jié)了組成、制備脂質(zhì)體所用的方法及其分析特性的差異。脂質(zhì)體的平均大小和多分散性指數(shù)(PDI)通過(guò)DLS測(cè)量，并且在表I中報(bào)告了Zeta平均值。通過(guò)不同HPLC方法測(cè)定了脂質(zhì)體的多柔比星、溶血素-PC和膽固醇含量。用標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽測(cè)定法測(cè)定磷脂含量或HSPC和DSPE-PEG2000的總和。總脂是磷脂和膽固醇含量的算術(shù)均值（表1）。
L- DOXp和L-DOXi的MLV制備方法有所不同。L-DOXP為將含脂乙醇溶液倒入攪拌下的硫酸銨水溶液中，L-DOXi為高壓注入。雖然L-DOXi和L-DOXp的平均尺寸和多分散性非常相似，但L-DOXp釋放DOX速度更慢，如下文所述。為了進(jìn)一步研究生產(chǎn)工藝對(duì)多柔比星釋放的影響，我們采用均質(zhì)法制備了脂質(zhì)體。與擠出制備的脂質(zhì)體相比，所得脂質(zhì)體的平均粒徑略小，PDI更高。通過(guò)均質(zhì)制備的脂質(zhì)體釋放DOX比擠出制備的脂質(zhì)體更快。為了研究流池法試驗(yàn)是否能夠區(qū)分緩釋和快速釋放制劑，我們用等量的POPC取代HSPC制備了脂質(zhì)體。POPC熔融溫度（-2℃）比HSPC（53℃）低，因此預(yù)計(jì)DOX會(huì)更快釋放。雖然HSPC替代POPC略微改變了脂質(zhì)與DOX的摩爾比，但質(zhì)量比保持不變。
3.2 透析裝置膜的選擇
透析袋/透析管可用作屏障，使釋放的多柔比星快速擴(kuò)散到釋放介質(zhì)中，同時(shí)保留仍包封在脂質(zhì)體中的所有多柔比星。為了找到能夠滿足這一要求的特定透析袋/管膜，通過(guò)在透析袋中直接添加游離多柔比星溶液來(lái)測(cè)試具有不同MWCO和材料的膜，以模擬所有藥物分子從脂質(zhì)體中釋放的條件。
結(jié)果表明，采用100-300kDa MWCO的Float-a-lyzer?CE膜可快速釋放多柔比星，在37℃下的7h內(nèi)釋放幾乎100%的多柔比星，而采用8-10kDa MWCO的膜在24h內(nèi)僅觀察到33.9% ±2.2%的累積釋放（見圖1)，100和300kDa MWCO膜的DOX轉(zhuǎn)運(yùn)速率無(wú)顯著差異，因此所有后續(xù)研究均使用300kDa MWCO膜。100-300kDa MWCO膜的孔徑范圍為5-8nm，比我們的脂質(zhì)體粒徑小得多。因此，仍包封在脂質(zhì)體中的多柔比星不會(huì)穿過(guò)膜。此外，釋放24小時(shí)后，在釋放介質(zhì)中未檢測(cè)到脂質(zhì)體，HPLC檢測(cè)沒(méi)有磷脂即可證明這一點(diǎn)。
3.3 多柔比星釋放試驗(yàn)初步開發(fā)
3.3.1 解決釋放介質(zhì)中的DOX沉淀問(wèn)題
在確定了游離多柔比星的適當(dāng)透析膜后，在SOTAX ?流池法溶出儀上進(jìn)行了多柔比星從脂質(zhì)體的釋放試驗(yàn)。建立了游離DOX溶液在各種釋放介質(zhì)中0-45μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線，包括10mM His/HCl和5%蔗糖（pH=6.5）、PBS（pH=7.4）和100 mM NH4HCO3/5%蔗糖（pH 6.0）。使用進(jìn)化陣列紫外可見分光光度計(jì)480nm檢測(cè)DOX，并在0-45μg/mL濃度范圍內(nèi)觀察到所有介質(zhì)的良好線性。初步藥物釋放，在介質(zhì)100mM NH4HCO3（5% 蔗糖，pH6）（圖2a）或PBS（pH7）中以40μg/mL總DOX濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，意外的是，在SOTAX ?流池法溶出儀的兩種介質(zhì)中均觀察到DOX沉淀。進(jìn)一步的研究表明，溶出儀的聚四氟乙烯表面形成了較小的紅色晶體，隨著時(shí)間的推移，其尺寸逐漸增大，最終導(dǎo)致多柔比星沉淀。為了探索儀器特氟隆表面或釋放介質(zhì)中的有限D(zhuǎn)OX溶解度是否為藥物沉淀的原因，在聚丙烯離心管中進(jìn)行釋放(參見常規(guī)釋放試驗(yàn)) 。在無(wú)聚四氟乙烯條件下，DOX沉淀的程度也較小。在離心管中加入特氟隆攪拌棒時(shí)，即使在DOX濃度低至3μg/ml下，也觀察到在特氟隆表面上形成紅色沉淀。為了避免在流池法溶出儀系統(tǒng)中釋放期間沉淀，我們將羥丙基環(huán)糊精(HP-CD)作為DOX溶解度增強(qiáng)劑添加到釋放介質(zhì)中。
添加1.5%、5%和20%時(shí)，HP-CD可提高DOX在釋放介質(zhì)中的溶解度。在向釋放介質(zhì)中添加HP-CD之前和之后，使用常規(guī)測(cè)定進(jìn)行釋放研究，48小時(shí)內(nèi)未觀察到DOX沉淀。在常規(guī)分析中添加特氟龍表面并在介質(zhì)中加入HP-CD不會(huì)導(dǎo)致多柔比星沉淀（圖2b）。初始釋放實(shí)驗(yàn)在37℃下于PBS，10mM his/HCl緩沖液或100mM NH4HCO3中進(jìn)行，然而，僅在NH4HCO3緩沖液中觀察到脂質(zhì)體釋放DOX。此外，DOX釋放百分比在pH5-7之間高度依賴于NH4HCO3溶液pH。發(fā)現(xiàn)pH6 介質(zhì)在24小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)DOX的累積釋放約50%，這足以區(qū)分基于中試研究的不同處方。然而，在37℃下釋放DOX期間，100mM NH4HCO3/5% w/v蔗糖介質(zhì)的pH從6增加至8，導(dǎo)致多柔比星的紫外吸收降低，這降低了分析準(zhǔn)確度。此外，在含蔗糖的介質(zhì)中觀察到細(xì)菌生長(zhǎng)。為避免pH在釋放過(guò)程中增加，在釋放介質(zhì)中加入緩沖至pH6.0的75mM MES。在釋放介質(zhì)中加入75mM MES后，pH的變化非常適中，37℃下48h后，pH由6增加至6.2，DOX紫外吸收保持不變。向釋放介質(zhì)中添加防腐劑0.02% w/v NaN3可防止細(xì)菌生長(zhǎng)。因此，我們選擇了含NH4HCO3、MES和NaN3的釋放介質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估。我們將此介質(zhì)縮寫為“AMNS”（碳酸氫銨、MES、NaN3、蔗糖）。然而，即使在存在100mM NH4HCO3的情況下，通過(guò)常規(guī)釋放試驗(yàn)（圖2b），在37℃下24小時(shí)內(nèi)DOX的釋放程度有限僅約7%，因此需要探索增加釋放速率的額外措施。隨后進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)考察溶出系統(tǒng)溫度對(duì)其釋放的影響。
3.3.2 流池溶出系統(tǒng)溫度對(duì)DOX釋放的影響
多柔比星的釋放與溫度高度相關(guān)，7小時(shí)內(nèi)多柔比星累積釋放百分比為91.0%±1.6%、42.4%±0.6%和4.5%±0.1%的試驗(yàn)溫度分別為55℃、45℃、37℃（圖2c）。DOX脂質(zhì)體主要組分HSPC的凝膠-液晶相變溫度(Tm)為53 ℃。當(dāng)溫度高于Tm時(shí)，釋放量顯著增加，這不足為奇。選擇45℃的溫度進(jìn)行后續(xù)研究，因?yàn)長(zhǎng)-DOXi的累積釋放百分比幾乎在24小時(shí)內(nèi)就可以釋放完全（95.3% ±1.2%），但釋放速率足夠慢，可以區(qū)分處方之間的差異。
3.3.3 流池法溶出儀釋放試驗(yàn)的優(yōu)化
3.3.3.1 不同濃度L-D0X對(duì)DOX釋放的影響
考察了L-DOX制劑與總釋放介質(zhì)的體積比對(duì)流池法中DOX釋放速率的影響。L-DOX的標(biāo)準(zhǔn)濃度為2mg/ml。將L-DOX稀釋至0.5、1和2mg/ml的濃度，并將1.6ml稀釋的L-DOX置于Float-a-lyzer?透析管中，將透析管插入流通池體中，并向每個(gè)釋放管路中添加78.4ml的釋放介質(zhì)。因此，100%的多柔比星釋放會(huì)在總釋放介質(zhì)中產(chǎn)生10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml的藥物濃度。初始L-DOX濃度越低，多柔比星累積釋放越高：分別在24h內(nèi)釋放了77.0% ±2.7%、60.9% ±0.6%和48.3 ±0.7%的mL（圖3a），由于多柔比星檢測(cè)最低濃度是精確的儀器中的濃度和多柔比星沉淀風(fēng)險(xiǎn)在最低濃度下較低，所有后續(xù)研究均使用總介質(zhì)中的10μg/ml的多柔比星濃度（透析管中多柔比星濃度為0.5mg/ml）。
3.3.3.2 環(huán)糊精類型和濃度對(duì)DOX釋放的影響
考察釋放介質(zhì)中HP-CD濃度對(duì)DOX釋放的影響。含1.5%、5%和20% HP-CD的釋放介質(zhì)的累積藥物釋放沒(méi)有顯著差異（對(duì)于1.5%的HP-CD和5%的HP-CD，f2為53.1；對(duì)于1.5%的HP-CD和20%的HP-CD，f2為52.7；對(duì)于5%的HP-CD和20%的HP-CD，f2為68.7）（圖3b），在含有5%和20% HP-CD的釋放介質(zhì)中未檢測(cè)到多柔比星沉淀，但在使用1.5%HP-CD時(shí)出現(xiàn)微量沉淀。
為了比較環(huán)糊精類型對(duì)DOX釋放的影響，將1.5%γ-CD、β-CD或HP-CD添加到含有100mM NH4HCO3、75mM MES、5%蔗糖和0.02%NaN3的釋放介質(zhì)中。由于β-CD的水溶性有限，實(shí)驗(yàn)在1.5%環(huán)糊精介質(zhì)濃度下進(jìn)行。與HP-CD和β-CD相比，γ-CD的DOX釋放更快（圖3c）。不幸的是，當(dāng)三種環(huán)糊精僅在1.5%濃度下使用時(shí)，都觀察到DOX的微量沉淀。為了避免DOX沉淀，對(duì)含有5%γ-CD和HP-CD介質(zhì)的藥物釋放進(jìn)行了研究。在含5%γ-CD介質(zhì)中，在7小時(shí)DOX累積釋放為89.5% ±3.1%，而含5%HP-CD介質(zhì)中的累積釋放為42.4% ±0.6%（圖3d）。對(duì)于5%γ-CD釋放介質(zhì)，DOX釋放太快，可能會(huì)降低區(qū)分不同L-DOX制劑的能力。此外，與HP-CD相比，γ-CD輔料成本更高，因此在釋放試驗(yàn)中使用γ-CD是不切實(shí)際的。因此，在優(yōu)化的釋放試驗(yàn)中使用了5%HP-CD。
3.3.3.3 NH4+對(duì)多柔比星釋放的影響
在流池法溶出儀上研究了釋放介質(zhì)中NH+濃度對(duì)DOX釋放速率的影響。NH4HCO3釋放介質(zhì)濃度對(duì)DOX釋放有顯著影響（圖4)，在沒(méi)有NH4HCO3的情況下，DOX釋放非常有限，釋放速率隨NH4HCO3濃度的增加而增加。因此，100mM NH4HCO3釋放介質(zhì)用于后續(xù)研究。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定了DOX脂質(zhì)體的流通池法釋放試驗(yàn)方法。優(yōu)化后的釋放介質(zhì)組成為100mM NH4HCO3、75mM MES和5%HP-CD、5%蔗糖和0.02%NaN3（pH6）。在45℃下以16ml/min的速度循環(huán)釋放介質(zhì)，24小時(shí)檢測(cè)DOX釋放，釋放介質(zhì)體積為80ml，總釋放介質(zhì)中DOX的最終濃度為10μg/ml，相當(dāng)于向透析管（Float-a-lyzer?）中添加1.6ml濃度為0.5mg/ml的DOX脂質(zhì)體。
3.3.3.4 釋放試驗(yàn)的有限確認(rèn)
通過(guò)使用相同的L-DOXi制劑在三個(gè)不同的日期運(yùn)行釋放試驗(yàn)，通過(guò)前述優(yōu)化的流池法溶出儀進(jìn)行釋放試驗(yàn)，分析了日間變異性。7小時(shí)和24小時(shí)的累積釋放量分別為47.0%±1.6%和96.5%±0.7%，表明測(cè)定方差有限，釋放曲線無(wú)顯著差異（第1天和第2天的f2為73.4，第1天和第3天的f2為63.4，第2天和第3天的f2為81.0）（圖5)，對(duì)照DOX溶液的UV強(qiáng)度變化在四個(gè)不同的日期進(jìn)行評(píng)估。
3.3.3.5 脂質(zhì)體組成和制備方法對(duì)DOX釋放的影響
為驗(yàn)證已建立的流池法釋放試驗(yàn)區(qū)分DOX釋放的能力，檢查了各種脂質(zhì)體制劑的差異（圖6)。將市售的Doxil?作為對(duì)照進(jìn)行分析。用POPC替代HSPC可在10小時(shí)內(nèi)快速完全釋放DOX（圖6a）。所有其他脂質(zhì)體的組成與Doxil?相同，但其理化性質(zhì)略有不同。通過(guò)f2計(jì)算定量評(píng)估了這些處方之間的DOX釋放差異（表2）。當(dāng)f2值大于50時(shí)，認(rèn)為兩種處方的釋放曲線相似。在表2中列出的多項(xiàng)比較中，這些比較的f2值小于50，并且認(rèn)為它們的DOX釋放行為彼此不同。
我們制備的所有制劑的DOX釋放速率均低于市售Doxil?。在制備的脂質(zhì)體中，使用高壓均質(zhì)(H-DOX)制備的脂質(zhì)體比L-DOXp表現(xiàn)出更快的釋放速率，24小時(shí)累積釋放分別為82.9%±0.3%和77.7%±1.3%（圖6a）。與L-DOXp平均粒徑為91.0±0.1 nm相比，H-DOX（79.4±0.3 nm）的平均粒徑更小，粒徑分布更寬。H-DOX粒徑的非均勻性可以解釋DOX釋放速率的加快。
在脂質(zhì)體擠出之前制備MLV的方法也對(duì)DOX釋放有影響。在硫酸銨水溶液中倒入脂質(zhì)溶液制備的MLVs（L-DOXp）的DOX釋放比在水溶液中高壓注入脂質(zhì)溶液制備的MLV（L-DOXi）要慢。此外，釋放介質(zhì)中存在環(huán)糊精和NH4HCO3不會(huì)導(dǎo)致以顆粒粒徑發(fā)生劇烈變化為特征的脂質(zhì)體崩解。在釋放過(guò)程中，脂質(zhì)體保持完整，并且僅進(jìn)行了有限的顆粒尺寸增加（表2）。
選擇釋放介質(zhì)是成功開發(fā)流池法釋放試驗(yàn)的關(guān)鍵。雖然低離子強(qiáng)度介質(zhì)10% 蔗糖和10mM his/HCl（pH 6.5）可以很好的溶解游離多柔比星，且不會(huì)引起明顯沉淀，但該釋放介質(zhì)不能誘導(dǎo)多柔比星從脂質(zhì)體中釋放。同樣，單獨(dú)使用PBS也不會(huì)誘導(dǎo)多柔比星釋放。近年來(lái)，有報(bào)道稱腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)谷氨酰胺分解產(chǎn)生氨，并誘導(dǎo)多柔比星從脂質(zhì)體中釋放出來(lái)。我們的初步研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加NH4+到釋放介質(zhì)中時(shí)，多柔比星的累積釋放顯著增加。此外，脂質(zhì)體釋放的多柔比星高度依賴于釋放介質(zhì)的pH和NH4+濃度。在100mM的相同NH4+濃度下，當(dāng)釋放介質(zhì)的pH從4.5增加到7.0時(shí)，脂質(zhì)體釋放的多柔比星累積百分比從0%增加到80%， 同樣，當(dāng)釋放介質(zhì)中的NH4+濃度從0增加到100mM時(shí)，多柔比星累積釋放百分比也會(huì)增加，這并不奇怪，因?yàn)槎嗳岜刃峭ㄟ^(guò)硫酸銨梯度法被加載到脂質(zhì)體中，并且多柔比星可以在脂質(zhì)體內(nèi)硫酸鹽存在下形成晶體。多柔比星作為游離有機(jī)堿，對(duì)脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙分子層具有高滲透性，但當(dāng)其質(zhì)子化并因此被捕獲在脂質(zhì)體內(nèi)時(shí)，則具有低滲透性。氨鹽在釋放介質(zhì)中pH依賴性分解后，NH3能夠穿透脂質(zhì)體膜，去質(zhì)子化多柔比星，并促進(jìn)其通過(guò)脂質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，當(dāng)氨在增加pH被中和時(shí)，釋放介質(zhì)中的氨變得更通透。因此，較高的pH和較高的NH4+濃度可誘導(dǎo)更多的多柔比星釋放。
然而，當(dāng)使用含NH4+的釋放介質(zhì)進(jìn)行釋放測(cè)定時(shí)，多柔比星會(huì)沉淀在流通池體和特氟隆管路，即使在低至3μg/ml的多柔比星濃度下，聚四氟乙烯的管路也會(huì)導(dǎo)致沉淀。為了避免釋放的多柔比星沉淀，HP-CD可以通過(guò)將客體分子封裝在空腔中，將其溶解到釋放介質(zhì)中，因此，添加HP-CD后未發(fā)生沉淀。然而，在釋放介質(zhì)中使用環(huán)糊精通過(guò)不同的機(jī)制增強(qiáng)了多柔比星釋放，環(huán)糊精能夠從脂質(zhì)體膜中提取膽固醇，從而提高膜的流動(dòng)性和通透性。24小時(shí)釋放研究完成后，對(duì)脂質(zhì)體中殘留膽固醇含量的HPLC分析以及釋放介質(zhì)的分析證實(shí)，有30%的膽固醇離開脂質(zhì)體，并在5%HP-CD釋放介質(zhì)中也有發(fā)現(xiàn)。在血漿中，可能發(fā)生與循環(huán)脂蛋白從注射的脂質(zhì)體中提取膽固醇類似的事件。
解決沉淀問(wèn)題后，進(jìn)一步優(yōu)化該釋放試驗(yàn)，以便在24小時(shí)內(nèi)幾乎完全釋放多柔比星，從而提高試驗(yàn)的區(qū)分能力，因而評(píng)估了釋放介質(zhì)中的多柔比星濃度、釋放介質(zhì)組成以及溫度的影響。溫度越高，多柔比星釋放速率越快，這并不奇怪，因?yàn)樵诟叩臏囟认拢さ牧鲃?dòng)性越高，膜的流動(dòng)性有助于銨離子進(jìn)入脂質(zhì)體，多柔比星從脂質(zhì)體中擴(kuò)散出來(lái)，以及環(huán)糊精提取膽固醇。此外，在較高的溫度下，NH3的生成速率較高，有效的多柔比星溶解度、擴(kuò)散和解離常數(shù)較高，從而加快了分子的遷移和反應(yīng)性。然而，過(guò)高的釋放速率（55℃）或過(guò)低的釋放速率（37℃）可能會(huì)掩蓋不同制劑之間的任何輕微差異，因此，使用中等釋放速率（45℃）作為釋放試驗(yàn)的溫度，這為區(qū)分不同制劑提供了更好的機(jī)會(huì)。
流池法測(cè)定的主要局限性在于測(cè)定條件本身確定了脂質(zhì)體釋放多柔比星的驅(qū)動(dòng)力。因此，該試驗(yàn)可主要用于確定多柔比星脂質(zhì)體制劑之間的相對(duì)差異，而不是確定體內(nèi)相關(guān)釋放行為。似乎NH4HCO3的存在和pH依賴性形成是溶解和釋放多柔比星的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)力。即使所有其他參數(shù)（如HP-CD和高溫）保持不變，在小于25 mM NH4HCO3時(shí)觀察到幾乎沒(méi)有多柔比星釋放（圖4）。L-DOX濃度分別為10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml時(shí)，加快的多柔比星釋放速率降低，這也歸因于多柔比星-硫酸鹽溶出期間透析管內(nèi)NH4HCO3與多柔比星脂質(zhì)體的比率較高和瞬態(tài)pH變化。雖然可以使用相同數(shù)量的NH3溶解多柔比星脂質(zhì)體，但隨后，它會(huì)溶解較高比例的總多柔比星，從而導(dǎo)致更完全的藥物釋放。
溫度對(duì)釋放速率也有明顯的影響（圖2c）。在含有HP-CD、MES和100 mM NH4HCO3的所有相同介質(zhì)中，在37℃下幾乎沒(méi)有觀察到多柔比星釋放，在55℃下快速且?guī)缀跞康乃幬镝尫旁?h內(nèi)達(dá)到平臺(tái)，與在45℃下持續(xù)釋放多柔比星形成對(duì)比。在55℃下，脂質(zhì)體膜類似流體，因此多柔比星可以通過(guò)膜快速擴(kuò)散，釋放介質(zhì)中HP-CD的存在有助于去除脂質(zhì)膜中的膽固醇，減少膜的有效過(guò)渡，并提高多柔比星滲透性。顯然，試驗(yàn)溫度顯著影響多柔比星的有效釋放速率，最終選擇的流池法參數(shù)與生理?xiàng)l件相差甚遠(yuǎn)。然而，加速釋放條件已被其他研究者用于建立基于流池法的聚合物微球評(píng)估方法。在流池法試驗(yàn)中，使用pH2.4的極端釋放介質(zhì)pH、添加10% 乙醇以及45℃、50℃、53℃和60℃的高溫來(lái)區(qū)分聚合物微球處方。
除釋放介質(zhì)組成和溫度外，流池法釋放裝置的設(shè)置本身也會(huì)影響多柔比星釋放。為了檢測(cè)脂質(zhì)體的藥物釋放，我們使用了透析裝置插入U(xiǎn)SP-4裝置。我們發(fā)現(xiàn)，透析膜代表了多柔比星從Float-a-lyzer ?擴(kuò)散到USP-4流通池的擴(kuò)散屏障，值得注意的是，高滲透性300 kDa透析管的釋放存在滯后時(shí)間，這使我們對(duì)釋放動(dòng)力學(xué)的有效觀察延遲了大約1小時(shí)（圖1中50%釋放的時(shí)間約為1小時(shí)）。因此，由于脂質(zhì)體制劑的釋放是在更長(zhǎng)的時(shí)間尺度上觀察到的(例如，半時(shí)間約7小時(shí))，我們正在觀察藥物從脂質(zhì)體釋放的動(dòng)力學(xué)有價(jià)值的表現(xiàn)（圖5)。然而，使用其他滲透率較低的50-10kDa透析膜會(huì)導(dǎo)致多柔比星溶液從Float-a-lyzer?中釋放顯著減慢和不完全釋放。這種影響可能取決于藥物的大小和疏水性，因此，對(duì)于難溶、分子量較大的藥物，這種影響可能更為嚴(yán)重。
選擇用于分析的最終條件與L-DOX的生理釋放條件相去甚遠(yuǎn)。USP-4試驗(yàn)條件的主要優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)是在12小時(shí)內(nèi)從Doxil?中觀察到超過(guò)80%的藥物釋放，以便能夠在試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間的24小時(shí)內(nèi)區(qū)分具有更快或更慢多柔比星釋放行為的脂質(zhì)體制劑。實(shí)際上，當(dāng)使用優(yōu)化的釋放試驗(yàn)來(lái)確定不同L-DOX制劑的釋放曲線時(shí)，它能夠區(qū)分慢釋放和快釋放脂質(zhì)體制劑。例如，POPC L-DOX的釋放速率比任何其他制劑都快，在10h內(nèi)釋放幾乎100%的多柔比星。這并不奇怪，因?yàn)镻OPC的相變溫度遠(yuǎn)低于其他脂質(zhì)體制劑。相變溫度較低的磷脂具有較高的流動(dòng)性，這使得分子更容易通過(guò)脂質(zhì)雙層運(yùn)輸。我們還發(fā)現(xiàn)，組成相同但通過(guò)不同方法制備的制劑，以及具有略微不同理化性質(zhì)的制劑，在體外表現(xiàn)出非常不同的釋放，均質(zhì)脂質(zhì)體具有更寬的粒徑分布（表1），與擠出制備的脂質(zhì)體相比，多柔比星釋放更快。通過(guò)均質(zhì)化縮小MLVs粒徑的工藝不能實(shí)現(xiàn)與擠出相同的粒徑控制。脂質(zhì)體粒徑分布越大，某些脂質(zhì)體的釋放速率越快。MLV制備方法似乎對(duì)多柔比星釋放速率有很大影響，因?yàn)長(zhǎng)-DOXi的藥物釋放比L-DOXp快。脂類或硫酸銨的層狀排列可能存在差異，有些脂質(zhì)體或小粒徑非均勻性低于DLS檢測(cè)能力，需要通過(guò)對(duì)不同脂質(zhì)體的顯微鏡分析進(jìn)一步解釋這種差異。
雖然未進(jìn)行正式的分析驗(yàn)證，但有限的確認(rèn)顯示，在不同日期（圖5）對(duì)同一L-DOX制劑進(jìn)行的分析變異性較低，多柔比星溶液對(duì)照信號(hào)強(qiáng)度的日間變異性較低。然而，我們發(fā)現(xiàn)多柔比星釋放速率強(qiáng)烈依賴于NH4HCO3溶液的離子強(qiáng)度和介質(zhì)的初始pH。這可能與藥物非臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范(GLP)的含量驗(yàn)證存在潛在問(wèn)題，因此，可能需要進(jìn)一步優(yōu)化氨鹽濃度和pH，以提高分析耐用性。此外，在每次USP-4儀器運(yùn)行中使用L-DOX標(biāo)準(zhǔn)制劑作為對(duì)照，并以與對(duì)照的百分比差異表示釋放度結(jié)果，這可以在GLP分析驗(yàn)證中實(shí)施。
我們研究中采用的設(shè)計(jì)原理和選擇適當(dāng)釋放條件的方法可能是開發(fā)其他通用復(fù)合脂質(zhì)體制劑分析的有用范例。
使用含100 mM NH4HCO3、5%蔗糖、75mM MES、0.02%NaN3和5%HP-CD的釋放介質(zhì)，在45℃下用流池法溶出儀進(jìn)行24小時(shí)的多柔比星脂質(zhì)體釋放試驗(yàn)。該釋放試驗(yàn)用于區(qū)分不同工藝制備的相似多柔比星脂質(zhì)體的差異。已建立的流池法試驗(yàn)可用于區(qū)分原研和仿制多柔比星脂質(zhì)體之間的可能差異，為設(shè)計(jì)更好的制劑提供有用的反饋，并可能將這些制劑的體外釋放行為與體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)聯(lián)系起來(lái)。
略
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