目的：基于分析方法質量源于設計（AQbD）理念，建立并優化吡羅昔康凝膠體外釋放實驗（IVRT）
方法：建立分析目標、確定關鍵分析屬性［體外釋放速率（IVRR）、初始采樣時間累積釋放量（Q0）、釋放度］；基于先前的知識與經驗，從分析目標中推導出有影響的方法變量，并利用石川圖進行系統總結，對影響的變量進行風險等級評估，篩選出關鍵方法變量（膜的種類、釋放介質的種類、上樣量）；對2種上樣量（150、300mg）、3種釋放介質（0.9% NaCl 溶液、pH 5.5 的磷酸鹽緩沖液和pH7.2 的磷酸鹽緩沖液）和3種膜［混合纖維素膜（MCE）、聚醚砜膜（PES）、聚四氟乙烯膜（PTFE）］進行2×3×3全析因實驗設計，采用擴散池法進行IVRT，將各時間點樣品進行HPLC定量分析，進一步計算Q0、釋放度和IVRR。利用JMP Pro 軟件對實驗結果進行建模分析，篩選最優參數。參考美國食品藥品監督管理局（FDA）、歐洲藥品管理局（EMA）要求對建立的IVRT進行膜惰性驗證，釋放介質驗證，線性、精密度和重復性考察，敏感性和特異性考察及耐用性考察。
結果：吡羅昔康凝膠IVRT采用靜態垂直擴散池（擴散面積1.767cm2，接收池體積12 mL），溫度32 ℃，轉速600 r·min?1，釋放介質為pH7.2磷酸鹽緩沖液、膜為MCE、上樣量為300mg，取樣時間為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0h，取樣方式為全部取樣。方法學驗證均符合要求。
結論：所建立的吡羅昔康凝膠IVRT可靠、耐用、具有區分力。

一、簡 介

體外釋放實驗（IVRT）目的是測定藥物從制劑中釋放的速度和程度。口服固體制劑IVRT 可以建立生物藥劑學分類系統（BCS）1和3類藥物生物等效性，從而實現臨床試驗生物豁免。皮膚外用半固體制劑如軟膏劑、凝膠劑、乳膏劑等的IVRT 亦是評價半固體制劑性能的有效手段，其測定的體外釋放速率（IVRR）受原料藥溶解度、粒徑、劑型流變性、處方工藝等多方面影響，是制劑微觀結構（Q3）的反映，是藥品的關鍵質量屬。歐洲藥品管理局（EMA）、美國食品藥品監督管理局（FDA）等監管機構已發布相關文件表示IVRT 可以作為生物等效性的評估工具替代臨床試驗，因此需要科學合理開發出可靠、耐用且具有區分力的IVRT方法。目前半固體制劑體外釋放方法主要有流通池法、浸沒池法和擴散池法。《美國藥典》對這3 種方法均有收載，日本藥局方收載了擴散池法，《中國藥典》僅收載了流通池法且不是用來測定半固體制劑體外釋放。其中擴散池因測定簡便、重現性好被廣泛使用。FDA發布的半固體制劑品種指南中，大部分亦推薦使用擴散池法進行IVRT研究。
分析方法質量源于設計（AQbD）是質量源于設（QbD）理念的延伸，其理念是通過設計而獲得穩健且經濟效益高的分析方法，目前已在高效液相色譜（HPLC）、超高性能液相色譜或快速分辨液相色譜等色譜方法開發中取得成功，該理念同樣可以應用到IVRT方法的開發。
吡羅昔康作為非甾體抗炎藥，具有解熱、鎮痛、抗炎作用。吡羅昔康對胃腸道有較大刺激性，而吡羅昔康凝膠經皮給藥，可規避口服制劑引起的一系列胃腸道不良反應，具有局部藥物吸收好、釋藥快等優點，臨床主要用來緩解局部疼痛。目前尚無關于吡羅昔康凝膠體外釋放研究的相關報道。因此，本研究以國內外半固體制劑、透皮制劑指導原則為依據，應用AQbD理念按以步驟利用擴散池建立吡羅昔康凝膠體外釋放方法：建立分析目標、確定關鍵分析屬性（CAA）、進行風險評估、識別關鍵方法變量（CMV）、實驗設計、建模分析、方法驗證。

二、材 料

2.1藥物及主要試劑
吡羅昔康凝膠（黑龍江天辰藥業有限公司，批號20220502，規格每支20 g）；吡羅昔康對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100177-201704，質量分數99.5%）；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、磷酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，Merck 公司）；混合纖維素膜（MCE）、聚醚砜膜（PES）、聚四氟乙烯膜（PTFE）（0.45 μm，天津市津騰實驗設備有限公司）。
2.2主要儀器
島津高效液相色譜儀（配備DGU-403在線脫氣機、LC-40D二元泵、SIL-40C自動進樣器、CTO-40S柱溫箱、SPD-M40 PDA 紫外檢測器），色譜柱為Waters SunFire C18（150mm×4.6mm，3.5μm）；干加熱自動透皮系統（推薦使用華溶TD-12AT PLUS 透皮擴散系統）；CPX8800H-C 超聲波清洗儀（美國Emerson 公司）；XA205 十萬分之一天平（梅特勒托利多公司）；Milli-QIQ7000 純水（MILLIPORE公司）；JMP Pro16.0 軟件。

三、方法與結果

3.1建立分析目標和確定CAA
分析目標即分析方法要達到的目標，是分析方法建立的基礎，只有確定了分析目標，才能建立有效、耐用、風險可控的分析方法。CAA來源于分析目標，是分析方法質量優劣的表征，表1、2 列出了本實驗的分析目標和CAA。

3.2　風險評估
基于先前的知識與經驗，從分析目標中推導出有影響的方法變量，并利用石川圖進行系統總結。對影響的變量進行風險等級評估，篩選出CMV。影響因素石川圖見圖1，風險等級評估見表3，上樣量、釋放介質類型、膜的類型是CMV。
3.3　實驗設計
使用JMP 軟件對篩選出的CMV 進行實驗設計，包括2 種上樣量（150、300 mg）、3 種釋放介質（0.9% NaCl 溶液、pH 5.5 的磷酸鹽緩沖液和pH7.2 的磷酸鹽緩沖液）和3 種膜（MCE、PES、PTFE），實驗設計結果見表4。
3.4　IVRT實驗
IVRT采用靜態垂直擴散池，溫度32 ℃，轉速600 r·min?1，取樣模式采用全部取樣，取樣時間為30 min 及1、2、3、4、5、6 h。
將IVRT 實驗中各時間點樣品進行HPLC 定量分析，具體方法見“2.5”項，進一步計算Q0、釋放度和IVRR（表4）。凝膠釋放符合Hugichi 方程，即單位面積累積釋放量（Q）與時間的平方根（√t）成正比，IVRR為Q和√t 的斜率。

V為釋放介質體積，A為釋放面積，Ci為取樣時間為i 時樣品濃度，將i=30 min 代入上述公式即為Q0

釋放度＝Q/（ A×上樣量×0.5%）
3.5　吡羅昔康分析方法及驗證
3.5.1　色譜條件
Waters Sunfire C18 色譜柱（ 150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動相0.1%磷酸-乙腈（65∶35）；檢測波長352 nm；進樣量10 μL；柱溫30 ℃；體積流量1 mL·min?1。
3.5.2　溶液配制
稀釋劑：pH 7.2磷酸鹽緩沖液；對照品儲備液：精密稱取10mg吡羅昔康對照品至10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋并定容；對照品溶液：將對照品儲備液稀釋至30 μg·mL?1。供試品溶液為IVRT實驗的樣品。
3.5.3　專屬性考察
精密量取對照品溶液、釋放1h樣品溶液、釋放介質溶液進樣測定，記錄色譜圖，見圖2。結果表明，在該色譜條件下，理論板數為13 205，目標峰與相鄰峰能達到基線分離，分離度大于1.5，本方法滿足檢測的需要。

3.5.4 進樣精密度考察
取對照品溶液，連續進樣6次，吡羅昔康峰的保留時間和峰面積的RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

3.5.5　線性關系考察
取對照品儲備液適量，用稀釋劑定量稀釋制成質量濃度分別為1、5、10、20、30、40、50、60 μg·mL?1的系列對照品溶液。取上述系列對照品溶液適量，按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為y＝31 290 x－4 394.1（r＝0.999 7）。結果表明，吡羅昔康質量濃度與峰面積在1～60 μg·mL?1線性關系良好。
3.5.6　檢測限和定量限考察
取對照品溶液適量，倍比稀釋，注入液相色譜儀，按信噪比10∶1 確定定量限，信噪比為3∶1 確定檢測限。經計算，吡羅昔康定量限為0.10 μg·mL?1，檢測限為0.03 μg·mL?1。
3.5.7　穩定性考察
取樣品溶液，分別在0、4、8、24h測定。吡羅昔康峰面積RSD均小于2.0%，說明溶液穩定性良好。
3.5.8　回收率考察
精密量取0.5 h 取樣時間樣品1 mL 置10mL 量瓶中，加入定量對照品儲備液0.1、0.3、0.5mL，制成低、中、高3 個質量濃度加標供試品溶液，平行制備3份。取上述系列待測溶液適量，按色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率。回收率為98.98%～101.88%，RSD均小于1.6%。
3.5.9　重復性考察
稱取樣品600 mg，置于10 mL量瓶，加稀釋劑定容，平行配制6 份，分別進樣，計算含量。樣品含量的RSD為0.4%，表明該方法重復性良好。
3.6　建模及方法優化
通過建模的方式評價CMV對CAA的影響及協同影響。利用JMP Pro 軟件對實驗結果（表4）進行建模分析，進行實驗設計和多項式模型求解，對所建模型進行統計學檢驗。模型預測表達式見圖3，表達式中的系數表明了CMV 對CVA 的影響程度，系數越大影響越大，系數為正表明有積極影響，系數為負，表明有消極影響。t 檢驗、方差分析表明所建模型合理，見圖4。
為使IVRT 響應最大化，采用意愿函數對CMV進行優化，意愿函數越接近1，響應值越接近目標值。使用JMP Pro 進行預測值刻畫，意愿函數最大為0.83，見圖5，此時CMV為上樣量為300 mg、釋放介質為pH 7.2 的PBS、膜為MCE，該參數為最優參數。
3.7　IVRT方法學驗證
3.7.1　膜惰性驗證
將MCE置于30 μg·mL?1 的對照品溶液中（32±1）℃ 、600 r·min?1 孵育6 h，重復3次，測定對照品溶液質量濃度前后變化，計算回收率。
3.7.2　釋放介質驗證
釋放介質需要滿足漏槽條件，測定pH 7.2 磷酸鹽緩沖液中吡羅昔康飽和溶解度。
3.7.3　線性、精密度和重復性考察
連續3 d 進行3組IVRT 實驗，每組6個，Q與√t 成線性，計算IVRR以表征IVRT方法的精密度和重現性。
3.7.4　敏感性和特異性
以市售吡羅昔康凝膠為原料，制備質量分數0.25%、0.375% 的吡羅昔康凝膠，進行IVRR 測定，評估IVRT 方法的敏感性和特異性。
3.7.5　耐用性考察
IVRT 溫度為（32±2）℃，轉速為（600±50）r·min?1時，考察方法的耐用性。IVRT方法學驗證可接受標準及結果見表5。

四、討 論

4.1 CMV選擇
吡羅昔康昔康凝膠屬于無限劑量樣品，上樣量選擇150、300 mg；0.9%氯化鈉水溶液比較接近人體皮膚生理狀態，人體皮膚表面呈弱酸性，因此選擇0.9%氯化鈉溶液、pH 5.5 磷酸鹽緩沖液和pH 7.2磷酸鹽緩沖液作為釋放介質。不同膜結構性能不同，選擇具有親水性的MCE、PES 和具有疏水性的PTFE。

4.2　CAA分析
通過繪制Q與√t 的關系得到的回歸線的斜率，即IVRR。IVRR 是IVRT 的CAA，也是評價半固體制劑質量一致性的重要工具之一。建模結果表明CMV中上樣量對IVRR的影響最大，其次是膜和釋放介質，膜與上樣量、介質的交互影響作用顯著，其余交互影響作用不顯著。Q0為30 min 時累積釋放量，旨在排除劑量傾倒的可能性，建模結果表明CMV 中膜、釋放介質和膜與釋放介質的交互影響具有顯著性。釋放度旨在評價釋放過程中質量守恒，表達式中釋放度的各項系數相對較小，表明該CAA受影響較小。

本研究以AQbD理念作為IVRT 方法開發的框架，從定義分析目標入手，確定CMA后，將IVRT 的影響因素進行全面剖析，并進行風險評估，確定CMV，采用2×3×3 全因子設計實驗，評估上樣量、膜的種類和釋放介質對CAA（IVRR、Q0和釋放度）的影響。對這些影響進行建模并通過t 檢驗和方差分析驗證所建模型。利用所建模型的預測功能，得到IVRT 釋放最大化的參數MCE、pH 7.2 磷酸鹽緩沖液和300 mg 的上樣量。根據歐洲和美國監管機構的最新指南，對優化后的IVRT 條件進行了膜惰性、線性、精度、耐用性性和區分力指標的評估，同時對HPLC法進行了驗證，證明該方法可靠、耐用具有區分力。

五、參考文獻

略 如需原文，請聯系小編(代老師15012941165)