翻譯：華溶應用中心
審核：工業藥劑發燒友

摘 要

體外釋放試驗(IVRT)方法對于監測制藥生產過程中批次間的質量變化以及表現仿制藥與原研藥的藥物等效性非常重要。為了滿足批準眼用混懸液仿制藥的監管要求，需要進行體外釋放研究。目前尚無藥典或非藥典方法用于奈帕芬胺眼用混懸液的體外釋放研究。
目前的研究旨在篩選使用不同的常規和非常規的各種方法，以建立最合適的奈帕芬胺眼用混懸液的技術，然后優化方法參數并進行驗證。試驗使用帶透析袋的槳法裝置（USP 2型）、流通池裝置（USP 4型）、水浴轉瓶裝置和Franz擴散池裝置。使用USP 4型裝置，在pH 7.4的模擬淚液（STF）中，藥物在120分鐘內的釋放度約為83%，添加表面活性劑月桂醇硫酸酯鈉（SLS）后，釋放度增加到約97%。使用USP 2型和Franz擴散池裝置，藥物釋放緩慢或未接近完全釋放。然而，在水浴轉瓶裝置的情況下，觀察到了突釋曲線。藥物釋放量的估計是通過HPLC方法進行的，所有方法驗證參數，如專屬性、準確度、線性和精密度都在可接受標準范圍內。

一、簡介
如果溶出度是藥物吸收過程中緩慢且限速的步驟，那么溶出度實驗就尤為重要。溶出度實驗主要用于確認產品質量和預測批次間的一致性。溶出度試驗的原理是在均勻攪拌下測試嵌入顆粒中的藥物的釋放情況，這通常是將介質通過樣品或通過在介質中旋轉樣品來實現的。美國藥典和其他藥典試驗包含幾種不同的溶出裝置，用于研究速釋口服，緩釋口服和非口服劑型。各種常規和非常規的溶出裝置可用于研究復雜劑型的溶出曲線，包括注射和眼用混懸液。第一類是藥典溶出裝置，包括籃法（USP 1型）、槳法（USP 2型）、往復筒法（USP 3型）、流池法（USP 4型）、槳碟法（USP 5型）、轉筒法（USP 6型）、往復架法（USP 7型）。此外，其他藥典裝置，如Franz擴散池和浸沒池，特別推薦用于半固體制劑，也可用于復雜混懸液的IVRT。第二類是非藥典IVRT裝置，包括帶透析袋的USP 2型、搖瓶法和水浴轉瓶裝置。
奈帕芬胺是一種黃色結晶粉末，前藥化學設計為2-氨基-3-苯甲酰基苯乙酰胺，分子式為C15H14N2O2，分子結構如圖1所示。奈帕芬胺是一種非甾體抗炎藥，以眼用混懸劑的形式用于治療尤其是與白內障手術相關的疼痛和炎癥。一旦奈帕芬胺穿透角膜，它就會被迅速生物活化為氨芬酸。此外，氨芬酸通過均勻地抑制COX-1和COX-2受體來顯示其活性。奈帕芬胺混懸液作為無菌眼科產品，以濃度為1 mg/mL的混懸液上市。

圖1. 奈帕芬胺的分子結構，即2-氨基-3-苯甲酰基苯乙酰胺

Bao等人報道了USP 4型裝置、USP 2型裝置和Franz擴散池法用于眼用軟膏的體外藥物釋放試驗。帶有透析袋、浸沒池或自制裝置的USP 2型裝置和帶有半固體適配器的USP 4型裝置已用于長效注射混懸液的體外釋放試驗。Veiga等人對用于治療眼部炎癥的基于奈帕芬胺的環糊精納米聚集體制劑進行了體外和離體評價。由美國食品藥品監督管理局（USFDA）發布和管理的溶出度數據庫不包括任何用于確定奈帕芬胺眼用混懸液藥物釋放的藥典或非藥典方法，它指出“開發一種表征體外釋放的方法”。表1總結了迄今為止用于各種眼科制劑體外釋放研究的裝置。

表1 眼用混懸液及眼膏的儀器一覽表

由于結膜囊在不眨眼的情況下容量較小（約30 微升），為眼用混懸制劑的體外藥物釋放研究選擇合適的溶出裝置模擬臨床使用條件是一項重大挑戰。此外，由于防御機制，淚液的稀釋和活性成分在吸收部位滯留時間短，會導致用藥部位藥物濃度降低。
在本研究中，通過高效液相色譜法，使用各種藥典和非藥典裝置，如流通池裝置（USP 4型）、水浴轉瓶裝置和Franz擴散池裝置，來判斷奈帕芬胺從其眼用混懸液中的釋放。為了進行比較，還考慮了使用大體積介質的裝置，如帶有透析袋的槳法裝置（USP 2型）。此外，還對奈帕芬胺眼用混懸液在模擬淚液中的分析方法（HPLC）和優化的溶出技術進行了驗證。

二、材料與方法
2.1 材料
市售1mg/ml奈帕芬胺滴眼液（NEVANECTM，由Alcon制造）。以PharmaCupboard公司生產的奈帕芬胺API（純度99.0%）為標準品。常用試劑氯化鈉（NaCl，AR級，Rankem）、碳酸氫鈉（NaHCO3，AR級、Finar（Extrapure，Finar）氯化鈣二水合物（CaCl2·2H2O，AR級，Finar）、氯化鈣（CaCl2，AR級、Rankem）、甲酸銨（（Extrapure，Finar）和鹽酸（Extrapure-Merck）用于本研究。月桂醇硫酸酯鈉（SLS）（Emparta，Merck）也用作介質中的表面活性劑，以加速藥物的釋放。所有化學品和常用試劑均為市售，并且在沒有進一步純化的情況下使用。

2.2 模擬淚液的制備
需要使用模擬淚液（STF）來測試眼用混懸液的藥物釋放曲線，以模擬給藥部位的微環境。它是通過將0.67g氯化鈉、0.2g碳酸氫鈉和0.008g二水合氯化鈣溶解在100mL純化水中制備的。使用稀鹽酸將STF的pH調節至7.4。

SLS是溶出研究中非常常見的表面活性劑。在本研究中，選擇0.75%濃度的SLS作為最佳濃度。我們已經在有和沒有SLS的情況下進行了溶解度測試，并觀察到沒有SLS就無法實現漏槽條件。因此，為了在介質中完全釋放，需要加入SLS。

2.3 實驗方法
本研究中使用的裝置為含有UV檢測器HPLC (Agilent 1260)、含有透析袋1000KD（Spectra/Por）的USP 2型槳法裝置（推薦使用華溶DS-1406 AT 全自動取樣溶出系統）、含有USP4型活塞泵流通池裝置（推薦使用華溶DS-7CP PLUS 流池法溶出系統）、水浴轉瓶裝置（Varco VRB Wu）和Franz擴散池裝置（推薦使用華溶TD-12AT PLUS 透皮擴散系統）。用高效液相色譜法和紫外檢測器對溶出樣品中的奈帕芬胺進行估算。我們將測試時間限制在2小時以內，因為樣品在使用后相對會更快地在眼內釋放，因此不希望測試時間持續很長。對于USP 4型和水浴轉瓶裝置，由于手動取樣的實驗限制，起始時間點為5分鐘。然而，對于Franz擴散和USP 2型裝置，選擇的最短時間點為15分鐘，因為溶解的藥物必須穿過作為屏障的膜。

溶出體積的選擇和重要。雖然，由于非常低的劑量（一滴; 約30微升）給藥至眼內液體量也非常低的眼睛，眼部給藥的體積非常低是可取的。我們嘗試去根據每種裝置的最小體積要求，將介質體積保持在盡可能低的水平。如果我們比較每個裝置試驗的藥物濃度，它都低于生物相關條件，這使得藥物釋放是一個連續的過程而不受溶解度限制。

2.3.1 奈帕芬胺的高效液相色譜分析
2014年，Usman等人報道了反相高效液相色譜法(RP-HPLC)對眼用混懸液中奈帕芬胺的定量分析。2015年，Rajput等人報道了用反相高效液相色譜法測定原料藥和眼用制劑中奈帕芬胺的含量。最近，Padhye等人采用了高效薄層色譜法(HPTLC)方法評價眼用混懸液中奈帕芬胺的含量。在本研究中，使用高效液相色譜法測定了奈帕芬胺在溶出介質中的釋放度。流動相為乙腈:10 mM甲酸銨緩沖液(甲酸調至pH 4.0):甲醇(27.5:45:27.5)混合液。流速保持1.0 mL/min。?max在238 nm處被檢測到，因為奈帕芬胺在238 nm處有強吸收，在378 nm處有弱吸收。樣品分離采用C8色譜柱(Agilent, eclipse 150×4.6 mm, 3.5 μm)，柱箱溫度為30°C，進樣量為20uL。使用Empower軟件3.6 (WatersTM)對色譜進行處理。優化并驗證了高效液相色譜分析的條件。

2.3.2 帶透析袋的USP 2型裝置
USP 2型裝置配備1000 mL溶杯，與透析袋一起用于奈帕芬胺眼用混懸液的體外釋放試驗。由于不溶性懸浮液顆粒中釋放藥物的分離問題，直接用槳法是不合適的，因此選擇USP-2槳法裝置的透析膜法用于該制劑。切開截留分子量(MWCO)為1000 KD (Spectra/Por) 的透析袋，用水沖洗2 - 3分鐘。用顯微鏡法測定眼用混懸液中奈帕芬胺有效成分（API）的平均粒徑(Primostar 1, Make Zeiss)。奈帕芬胺混懸液的平均粒徑分布(PSD)為(2.05±0.25)μm。雖然孔徑大小和膜的MWCO之間沒有直接關系，但是根據Kovacs等的報道，超過1000 KD的膜的孔徑被假定在2 nm以內，這與奈帕芬胺混懸顆粒的PSD相比是非常小的。此外，奈帕芬胺的分子量為254.25道爾頓(0.254 KD)，遠小于1000 KD膜。因此，溶解后的API很容易穿過透析袋，而固體API顆粒比1000 KD膜的孔徑大得多，所以它不能穿過膜。

將膜袋的一側折疊并夾緊。然后用移液管轉移1 ml眼用混懸液，夾在另一端密封膜。將透析袋分別放入500 ml不含SLS、SLS濃度為0.75% w/v的STF的溶出裝置中。槳轉速為100 rpm，溫度為35±0.5°C。樣品(0.1 ml)在15、30、45、60、90和120 min的設定時間間隔內取樣，并在“奈帕芬胺的HPLC分析”一節中討論的條件下進行HPLC分析，用于奈帕芬胺的定量。用STF替換為HPLC分析取走的溶液的體積。

2.3.3 閉環系統的USP 4型裝置
USP 4型流通池裝置可在不同條件下操作;它可以在開環和閉環系統模式運行。此外，它可以在不同的流速和溫度下運行。有各種類型的池體可用于此裝置。該裝置可用于測試各種劑型，如片劑、粉末、栓劑、明膠膠囊等。因此，它是緩釋和難溶性藥物的首選方法。事實上，在2018年，Forrest等人就使用了該裝置用于低水溶性化合物的納米混懸劑。

USP 4型流通池裝置的22.2mm池體，用于進行奈帕芬胺眼用混懸液的釋放測試。簡而言之，將0.5 ml的奈帕芬胺混懸液裝入流通池。混懸劑面臨的挑戰是將混懸顆粒保留在池體中，因為那些通過過濾器的顆粒會導致錯誤的釋放曲線。為了克服這一挑戰，一個0.2μm的過濾器被夾在一個玻璃纖維過濾器(Whatman GF/D，孔徑:2.7μm)和一個0.1μm的PVDF過濾器中間。將玻璃棉填充在流通池內，以避免顆粒進入溶出介質。然后，將流通池與流通池閉合頭固定并安裝到池體支架中。在50 mL無SLS和0.75% w/v SLS的STF中，在35±0.5°C下釋放。以2 mL/min的流速測試釋藥曲線。在此過程中，沒有觀察到過濾器組合上的堆積或結塊。樣品(0.5 mL)在5、10、15、20、30、45、60、90和120 min的設定時間間隔內取樣，并使用“奈帕芬胺的HPLC分析”一節中提到的色譜條件進行HPLC分析。在本研究中，USP 4型裝置在介質再循環的閉環系統模式下運行，因此在實驗過程中沒有觀察到介質損失。同時，未觀察到降解產物峰，說明該藥物在釋放介質中是穩定的。經體外釋放試驗，終濃度與理論濃度較符合。

2.3.4 水浴轉瓶裝置
水浴轉瓶裝置是一種非藥典裝置，非常罕見用于研究溶出。在Digesan Retard膠囊注冊期間，向國家衛生警備局提交了使用水浴轉瓶裝置的溶出方法。在本研究中，0.2mL的奈帕芬胺混懸液放置在裝有10mL溶出介質的水浴轉瓶中。溶出溫度為35℃±0.5℃，轉速為50 rpm。溶解5、10、15、20、30、45、60、120 min后，取0.5 ml樣品，8000 rpm離心5 min。取上清液放入高效液相色譜法定量釋放藥物分析。這個試驗重復了三次。

2.3.5垂直Franz擴散池裝置
2020年，Veiga等人為了尋找環糊精滴眼液制劑中奈帕芬胺的擴散，使用了配有醋酸纖維素膜過濾器的Franz擴散池。垂直Franz擴散池(FDC)裝置一般用于局部半固體產品的IVRT。垂直Franz擴散池裝置用于氟尼龍眼用混懸液。用12.5 mL STF完全填充受體室。采用不含SLS，含0.75% SLS的pH 7.4的STF進行釋藥試驗。浴液溫度設定為35℃± 0.5℃。采用PVDF 0.2 μm (Merck, Millipore)盤式過濾器作為人工膜。在分析開始前，用STF介質使膜飽和約30min。然后，在飽和膜上的供體室中，裝入0.3 mL樣品和0.3 mL介質，將白色硅環、旋緊玻璃池體和金屬池體環依次放置在Franz擴散池上。所有的池體部件都借助夾子固定在一起。以600 rpm的轉速攪拌Franz擴散池。在設定的取樣時間點從受體室中取出0.5 mL的樣品，按照“奈帕芬胺的HPLC分析”章節中提到的色譜條件進行HPLC分析。

2.3.6 分析方法驗證
方法驗證參數如專屬性、線性、重復性、精密度、準確度、回收率等，按照分析方法驗證程序應用于奈帕芬胺眼用混懸液IVRT法中釋放藥物的高效液相色譜檢測，方法在ICH Q2(R1)指南中有詳細說明。

2.4 百分比釋放計算和統計分析
利用式(1)計算藥物釋放的百分比(%)，

其中所有參數都有自己的含義，如下所示。AT和AS分別為奈帕芬胺 HPLC色譜儀的測試峰面積和標準樣品的峰面積。SC是標準濃度(mg/mL)，是根據溶解在稀釋劑中的標準品總量和進一步稀釋(如果有的話)計算出來的。TC為試驗濃度(mg/mL)。這是通過考慮不同技術的稀釋系數得到的。P代表基于所使用的奈帕芬胺測定的標準品效價。LC是測試產品的標示量，即1mg /mL。使用Excel和/或OriginPro 2018軟件進行統計數據分析和繪圖。三次測量的平均值(即n = 3)在最終的釋放百分比與溶出時間圖中取。數據以平均值±標準差(SD)的格式表示。

三、討論與結果
使用各種溶出裝置進行的體外藥物釋放實驗的結果將在以下章節中提出和討論。在進行藥物釋放試驗之前，采用水浴轉瓶法測定了奈帕芬胺原料藥在含SLS和不含SLS的溶出介質中的飽和溶解度，然后在35℃下進行HPLC分析，觀察SLS對溶解度的影響，并建立漏槽條件。無SLS時的最大溶解度值為0.03 mg/mL，添加SLS后的最大溶解度值增加了10倍，見表2。

表2 奈帕芬胺API在無SLS和有SLS的選定介質中的溶解度。

無SLS時在35℃介質中振蕩1 h后的溶解度值為0.02 mg/mL，接近25℃水中的0.0197 mg/mL,但比環糊精配方的溶解度值(1.68 - 2.61 mg/mL)低一個數量級。在所有選擇的技術和設備中，相對于樣品上樣量和介質體積，介質中API的最大濃度(0.024 mg/mL)遠低于SLS介質中API的溶解度(0.32 mg/mL)。在所選擇的四種裝置中，所選擇的樣品上樣量和介質體積均在漏槽條件內，因此不存在因奈帕芬胺飽和而導致藥物釋放的限制因素。

3.1 帶透析袋的USP 2型裝置
采用USP 2型裝置，配以1000ml的溶杯，對奈帕芬胺眼用混懸液進行體外釋放試驗，可獲得較好的流體動力學特性，為釋放的藥物從膜中透過提供了有利條件。選擇1000 KD的MWCO透析袋，因為在混懸液中發現奈帕芬胺原料藥的粒徑為(2.05±0.25)μm，遠遠大于膜的孔徑(最大2nm)，這在實驗方法章節中有詳細的討論。因此，可以消除不溶性藥物干擾釋放曲線的可能性。使用USP 2型裝置獲得的奈帕芬胺眼用混懸液的釋放百分比曲線如圖3(a)所示。從圖3(a)中可以清楚地看出，藥物奈帕芬胺從制劑中逐步釋放，并且在2小時內發現藥物釋放<40%。表面活性劑SLS(0.75%)的存在導致藥物釋放平均增加4%。

3.2 USP 4型裝置(閉環)
USP 4型流通池溶出方法在介質體積和樣品的可重復定位上提供了完全的靈活性。介質的循環是均勻的，程序是更加標準化的，因為顆粒在玻璃珠之間，因此顆粒沒有被困住的可能。使用USP 4型裝置獲得的眼用混懸液中奈帕芬胺的釋放百分比如圖3(b)所示。藥物釋放曲線在60分鐘內呈合理的遞增趨勢，最終變得更慢，并在120分鐘內達到平臺期。在不含表面活性劑SLS的條件下，溶出120 min后藥物釋放量為83%;在含有0.75% SLS的條件下，藥物幾乎完全釋放(97%)。

3.3 水浴轉瓶裝置
選擇水浴轉瓶裝置是為了與其他方法比較所獲得的釋放曲線。在裝上樣品進行HPLC分析之前，樣品已經過離心;因此，可以消除不溶性藥物顆粒對釋放曲線產生影響的可能性。在水浴轉瓶裝置的幫助下獲得的藥物釋放曲線如圖3(c)所示，表明藥物立即釋放。Sanghvi等人報道茶堿類片劑在水浴轉瓶裝置中長達45分鐘的溶出試驗中，在水浴轉瓶裝置溶出5分鐘后出現類似的立即釋放曲線。當使用SLS和不使用SLS時，釋放曲線會有顯著的差異(約10%)。在達到平穩之前，最初的陡峭曲線可以解釋為由于儀器中的高剪切力導致懸浮顆粒的快速增溶，從而得到澄清溶液，表明奈帕芬胺混懸液接近完全溶解。此外，在水浴轉瓶中，懸浮顆粒往往會一次又一次地撞擊玻璃管的壁，從而產生磨損，與通過流通池(FTC, USP 4)的流動相比，懸浮顆粒的溶解速度必然更快，因為流通池中通過玻璃珠的流動是層流的，非常溫和。因此，水浴轉瓶溶出法不適合奈帕芬胺眼用混懸液的IVRT研究。

3.4 垂直Franz擴散池裝置
垂直Franz擴散池(FDC)裝置主要用于局部和半固體制劑的方法開發。雖然與其他儀器相比，該儀器的操作程序不那么復雜，但池體受體室的體積有限，通常為12ml，因此，受體室中需要更多的溶劑來滿足漏槽條件。作為液體制劑，FDC的樣品注入具有挑戰性。此外，在攪拌子的攪拌過程中，有可能形成氣泡并被困在受體室中。

使用垂直Franz擴散池裝置得到的奈帕芬胺眼用混懸液釋放曲線如圖3(d)所示。它顯示釋放曲線本質上是遞增的。不到25%的藥物在2小時內釋放，這表明延遲或不完全釋放。使用0.75%的SLS導致釋放速率的提高，但沒有達到接近完全釋放。這主要是由于奈帕芬胺在12ml介質中的溶解度有限。雖然，由于眼部液體少和具有更好相關性的機會，低體積的介質對于眼科產品的研究是可取的。與Franz擴散池相比，水浴旋轉裝置中的藥物釋放速度更快。因為在前一種情況下，混懸液直接與介質接觸，而在后一種情況下，在樣品和介質之間有一層膜。

圖3所示。使用(a) USP-2透析袋，(b) USP-4裝置閉環，(c)水浴旋轉裝置，(d)垂直Franz擴散池獲得的奈帕芬胺眼用混懸液的體外釋放曲線。

3.5 分析方法驗證
在2.3.1節所述的優化色譜條件下，奈帕芬胺標準品(即0.01 mg/ml)的HPLC圖譜如圖4(A)所示。在奈帕芬胺的保留時間為4.352 min時出現一個峰值。作為分析方法驗證研究的一部分，我們通過生成不同濃度的奈帕芬胺標準溶液的色譜圖來檢查儀器響應的線性。圖4(B)(a - g)為標準奈帕芬胺在1.1、3.3、5.6、8.9、11.1、13.4和17.8 μg/ml不同濃度下的覆蓋HPLC圖譜。由此可見，在(1.1 -17.8)μg/ml的濃度范圍內，響應面積與奈帕芬胺標準溶液的濃度成正比。

圖4所示。(A) 奈帕芬胺0.01 μg/ml標準制劑的HPLC圖譜，(B)不同濃度下奈帕芬胺標準溶液1.1 μg/ml (A)、3.3 μg/ml (B)、5.6 μg/ml (c)、8.9 μg/ml (d)、11.1 μg/ml (e)、13.4 μg/ml (f)、17.8 μg/ml (g)的HPLC圖譜，(c)眼科混懸液中奈帕芬胺的HPLC圖譜，準確度分別為50% (A)、100% (B)、150% (c)。

為了更好地理解它，我們繪制了響應面積與濃度的相關性圖，如圖5所示。在1.1 μg/mL -17.8 μg/mL濃度范圍內，濃度與面積線性關系的相關系數為R2 = 0.9999，在接受范圍內。回收率的準確度為目標濃度的50%到150%。結果是99.9%-100%。圖4C(a - c)為眼用混懸液中奈帕芬胺在50%、100%和150%三個濃度水平下的HPLC圖譜。6個樣品制備的精密度RSD在60 min時為0.90,12個樣品制備的中間精密度總體RSD在60 min時為5。驗證研究表明，體外釋放試驗方法對奈帕芬胺具有專屬性，不受空白和稀釋劑在主峰保留時間的影響。該方法是線性的、準確的、精密的。

圖5所示。使用響應面積對不同濃度的標準奈帕芬胺獲得的校準曲線如圖4(B) (a - g)所示。

四、結論
在開發溶出方法的過程中，有必要對幾種溶出技術進行評估，以獲得理想的釋放曲線，并實現以盡可能短的持續時間和盡可能低的介質體積的目標。本研究只選取符合上述要求的溶出儀進行研究。
采用高效液相色譜法對奈帕芬胺原料藥在不同釋放研究樣品中的含量進行了測定。對分析方法進行專屬性、準確度、精密度和線性驗證，所有參數均在一般接受標準內。

由于體積小，垂直Franz擴散池技術似乎最適合于眼科產品的IVRT研究，然而，結果表明擴散池不適合該制劑。同樣，水浴旋轉裝置也不適合，因為可以立即觀察到快速釋放，這可能是由于混懸顆粒受到的高剪切力所導致。使用USP 2型裝置并通過透析袋進行擴散是為了在混懸液和釋放的藥物之間提供屏障。透析袋研究的結果沒有達到預期的結果。

與本研究中使用的其他三種裝置相比，USP 4型裝置的釋放曲線最好，重現性好，也許是因為它提供了溫和流動的IVRT介質進入裝有樣品的池體。這清楚地表明USP 4型裝置是最適合研究奈帕芬胺眼用混懸液IVRT的裝置，這類產品的目標釋放應該在較短的時間內遞增釋放，并且釋放應該接近100%。只有USP-4符合這些標準，因此我們可以說在這里提出的4種技術中USP-4是最合適的。

五、參考文獻

略
如需原文，請聯系小編（代老師 15012941165）