時間:
翻譯：工業藥劑發燒友Summer
審核：華溶應用中心
長效注射混懸劑難溶性藥物晶體在體內緩慢溶解，可將藥物體內釋放時間延長到數周至數月。迄今為止，FDA已經批準了大約10種長效注射混懸劑，但大多數都沒有等效的仿制藥，很可能是由于復雜的處方工藝以及建立體外-體內相關性（IVIVC）方面的困難。基于動物模型的A級IVIVC已被證明可用于具有多相釋放特征的復雜長效微球。長效注射混懸劑的釋放特性相對簡單，只有一個藥物溶出階段，因此可建立IVIVC。為了建立長效注射混懸劑的體內外相關性，以長效注射醋酸甲羥孕酮（Depo-SubQ Provera 104）為上市參比制劑，制備了四種活性成分相同但處方和工藝（藥物粒度和輔料來源）不同的醋酸甲羥孕酮長效注射混懸劑。然后使用兩種基于USP裝置二（帶有浸沒池）和USP裝置四（帶有半固體適配器）改進的體外釋放測試方法，通過兔模型研究體內釋放，并使用USP裝置四法獲得了體外釋放曲線，成功建立了A級IVIVC。
長效注射混懸劑難溶性藥物晶體在體內緩慢溶解，可將藥物體內釋放時間延長到數周至數月。迄今為止，FDA已經批準了大約10種長效注射混懸劑，但大多數都沒有等效的仿制藥，很可能是由于復雜的處方工藝以及建立體外-體內相關性（IVIVC）方面的困難。基于動物模型的A級IVIVC已被證明可用于具有多相釋放特征的復雜長效微球。長效注射混懸劑的釋放特性相對簡單，只有一個藥物溶出階段，因此可建立IVIVC。為了建立長效注射混懸劑的體內外相關性，以長效注射醋酸甲羥孕酮（Depo-SubQ Provera 104）為上市參比制劑，制備了四種活性成分相同但處方和工藝（藥物粒度和輔料來源）不同的醋酸甲羥孕酮長效注射混懸劑。然后使用兩種基于USP裝置二（帶有浸沒池）和USP裝置四（帶有半固體適配器）改進的體外釋放測試方法，通過兔模型研究體內釋放，并使用USP裝置四法獲得了體外釋放曲線，成功建立了A級IVIVC。
IVIVC是一種預測數學模型，用來研究不同劑型藥物的體外溶出與體內釋放之間的關系。成功的IVIVC可用于制定釋放/溶出測試規范，當建立了人體內的A級相關性時，可代替體內BE研究。在藥物初次批準過程中以及在獲批后出現微小變更（例如生產場所變更）時，IVIVC可以減輕BE研究的臨床負擔。迄今為止，關于IVIVC的建立、評估和應用，僅有一項針對緩釋口服劑型的FDA指南。因此在過去20余年里，科學家們不得不依賴這一指南來開發非口服制劑。一項針對IVIVC研究的行業調研顯示，半數受訪者很少或從未建立過非口服劑型的IVIVC模型。FDA已批準的長效注射混懸劑產品中，只有Invega Sustenna提供了針對不同粒徑的臨床A級IVIVC 。近年來，由于人體研究相對困難并且昂貴，非臨床動物模型已被用于非口服劑型IVIVC的研究，可能為人類IVIVC的建立鋪平道路，例如各種聚乳酸-甘氨酸微球制劑如地塞米松、利培酮、納曲酮、醋酸亮丙瑞林，已經通過兔模型成功建立了A級（點對點）IVIVC。
在IVIVC模型研究中，根據所選制劑的藥代動力學特征，動物模型或人體受試者的體內吸收（血藥濃度-時間變化）呈現出恒定的規律。但當使用不同的體外釋放/溶出方法（設備、釋放介質、溫度、攪拌速度和上樣方式）時，所選制劑的體外釋放曲線可能會有所不同。因此，選擇合適的體外釋放/溶出方法來建立IVIVC至關重要。盡管FDA已經推薦了一些長效注射混懸劑的體外釋放檢測方法，但它們的持續時間較短（30分鐘至2天），可能不足以建立用于長效注射混懸制劑的IVIVC（體內有效持續時間為數周至數月）。本文開發了一種能夠延長注射混懸劑體外釋放時間的方法，有望用于IVIVC的研究。
在IVIVC模型研究中，根據所選制劑的藥代動力學特征，動物模型或人體受試者的體內吸收（血藥濃度-時間變化）呈現出恒定的規律。但當使用不同的體外釋放/溶出方法（設備、釋放介質、溫度、攪拌速度和上樣方式）時，所選制劑的體外釋放曲線可能會有所不同。因此，選擇合適的體外釋放/溶出方法來建立IVIVC至關重要。盡管FDA已經推薦了一些長效注射混懸劑的體外釋放檢測方法，但它們的持續時間較短（30分鐘至2天），可能不足以建立用于長效注射混懸制劑的IVIVC（體內有效持續時間為數周至數月）。本文開發了一種能夠延長注射混懸劑體外釋放時間的方法，有望用于IVIVC的研究。
2.1 材料
DMSO （USP級）購自Sigma-Aldrich（St.Louis，MO，USA）。戊烷，磷酸氫二鉀，含0.1%甲酸的乙腈（v/v），LC/MS級Optima?和含0.1%甲酸（v/v）的水， LC/MS級Optima?購自Fisher Scientific（Hampton，NH，USA）。Depo SubQ Provera 104mg醋酸甲羥孕酮注射混懸液（104mg/0.65mL）購自Pfizer Inc。醋酸甲羥孕酮（微粉化，USP級）購自Spectrum Chemical Manufacturing Corp（New Brunswick，NJ，USA）。甲羥孕酮17-乙酸酯-d3（MPA-d3）購自TLC Pharmaceutical Standard ltd（Ontario，Canada）。MiniCollect 0.8ml肝素分離管購自Greiner Bio-One North America Inc。（Monroe，North Carolina，USA）。除非另有說明，否則所有材料均為分析級。
2.2 MPA混懸液的制備及體外釋放數據
首先用四種方法制備MPA混懸劑 ：使用MPA原料藥制備的制劑1（F1）；使用重結晶制備的制劑2（F2）(反溶劑法:丙酮與水之比為1:1，分別作為良溶劑和反溶劑)；通過探針超聲處理制備的制劑3（F3）；制劑4（F4）除了使用不同來源的PEG 3350（F1：來自Spectrum Chemicals；F4：來自BASF）外與F1相同。使用馬爾文粒度儀測定所有制劑的粒徑，記錄Dv10，Dv50和Dv90，所有實驗重復三次，然后計算跨度值（（Dv90-Dv10）/Dv50）來評估混懸劑的粒度分布，所有數據均以均數±標準差表示。
所有MPA混懸劑的體外釋放數據均來自之前的一份報告，其中使用了兩種裝置，分別為帶有浸沒池（4cm2接觸面積）的USP裝置二（推薦使用華溶儀器DS-1206AT全自動取樣溶出系統）和帶有半固體適配器（1mm深度）的USP裝置四 (圖1)（推薦使用華溶儀器DS-7CP流池法溶出系統）。
2.3 MPA混懸劑的體內釋放研究
2.3.1 MPA混懸劑的動物研究
以兔為模型研究了MPA混懸劑和商業產品Depo SubQ Provera 104在體內的釋放情況。將體重約4kg的雌性新西蘭白兔隨機分配到每個制劑組（n=6）。將每種制劑以26mg/kg的劑量皮下注射（0.65mL）。為了獲得藥物PK參數，MPA藥物溶液（在DMSO中）也以4 mg/kg的劑量進行靜脈注射（n=6）。以預定的間隔從耳緣靜脈收集血液樣品并置于肝素分離管中。樣品在5000rpm的速度下離心5分鐘得到血漿，然后在-80℃環境下儲存直到分析。本研究動物模型的選擇是基于以下幾點原因:（1）PK研究的持續時間長達3個月，為確保有足夠的血容量用于長時間的連續采樣，認為較大的動物（如兔子）比較合適;（2）MPA用于避孕，因此選擇雌性動物。為保證動物試驗的安全性，本研究所采用的給藥劑量均按相關文獻規定，并確保給藥后的血藥濃度能被檢測出來，本研究按照康涅狄格大學機構動物護理和使用委員會（IACUC）審查和批準的方案進行。
2.3.2 樣品制備
超高效液相色譜（UPLC）
采用Vanquish UPLC系統（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）進行樣品分離。并使用Kinetex EVO C18 （50 mm*2.1 mm, 2.6μm）和帶有SecurityGuard?超濾筒的預柱（Phenomenex Inc, Torrance, CA, USA），將柱溫箱溫度設置為30℃。流動相由兩種溶劑混合物組成，A為含0.1% v/v甲酸的水；B為含0.1% v/v甲酸的乙腈； LC/MS級Optima)，用8分鐘梯度法（表1）以0.3 mL/min的流速洗脫系統，進樣體積為20μL。
在全掃描模式下使用配備OptaMax?NG電噴霧(H-ESI)離子源(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)的Thermo Scientific?高分辨率Orbitrap Exploris?480質譜儀 (質量范圍:2500 - 425.00m/z，分辨率:120,000)。對MS參數進行優化來獲得目標藥物分子的最佳強度。離子源參數設置如下：噴霧電壓為3700V的正離子模式;護套氣體流量為70Arb;輔助氣體流量為23Arb;掃掠氣體流量為5Arb;離子轉移管溫度為400°C;汽化器溫度為525°C。方法總時間為8min。藥物MPA和內標（MPA-d3）的親本離子質量分別為387.2525m/z和390.2700m/z。通過Thermo Scientific Xcalibur?軟件(4.4版本)進行數據采集和分析。
MPA和內標的保留時間均為4.81min。除最低濃度（0.5ng/mL）的回收率約為70%外，其他濃度MPA的回收率均在90%-101%范圍內。校準曲線建立在0.5-50 ng/mL和50-1000ng/mL范圍內，線性良好（R2>0.9995），準確度小于15%，精密度小于10%。
2.4 統計分析
使用OriginPro 2017軟件（OriginLab Corporation）進行線性回歸和擬合。數據以平均值±標準偏差（SD）表示。
2.5 IVIVC建立
為了研究用于MPA混懸劑的IVIVC，使用Phoenix WinNonlin軟件和IVIVC工具包（版本6.4，Certara Inc.，NJ，USA）進行數據分析。目前的研究集中在A級IVIVC（體外溶出度與體內釋放速率之間的點對點關系），因此它是最具參考性的，以下是數據分析的三個主要步驟。
步驟1：體外數據輸入
步驟2：體內釋放數據輸入
在軟件中通過數據反卷積處理獲得所選MPA混懸劑的體內釋放曲線。以靜脈注射劑的藥代動力學特征為參考。設定單位脈沖響應（UIR）指數的最大值為2，采用Akaike模型進行數據反卷積。
步驟3：預測和驗證相關性
通過軟件計算得到吸收比例因子（scaling factor for absorption）、時間比例因子（scaling factor for time）、時移因子（time shifting factor），用不同的縮放和/或移位因子建立體外和體內釋放數據之間的相關性，在此基礎上對所建立的IVIVC進行驗證，并對AUC和Cmax的預測誤差百分比（%PE）進行分析。根據FDA口服緩釋劑型IVIVC研究指南 ，IVIVC % PE的合格標準是:（1)對于體內預測性，Cmax和AUC的平均% PE≤10%。此外，每種制劑的%PE不應超過15%;（2）如果體內預測性不確定，則應通過體外預測性來最終確定IVIVC是否能夠替代BE;（3）對于體外預測性，Cmax和AUC的%PE應≤10%。
3.1 粒徑與粒徑分布
表2列出了MPA混懸劑（F1、F2、F3和F4）及RLD的粒徑和粒徑分布。排列順序如下：F3
3.2 所有制劑的體內藥物釋放
以家兔為實驗對象，對MPA混懸劑和RLD進行體內藥物釋放研究。為了獲得PK曲線，所有制劑均經皮下注射 (圖2B)。還進行靜脈注射藥物溶液（圖2A）用于反卷積處理獲得PK參數。為了獲得PK曲線的清晰視圖，圖3A顯示了平均值曲線。使用Phoenix WinNonlin對所有制劑的體內釋放曲線進行反卷積。反卷積建立在非區室分析（NCA）的基礎上，詳細的方程推導可以在（Certara.com）中找到。為便于比較，還展示了先前報道的測試制劑的平均體外釋放曲線（圖3CD），粒徑是分散體系（混懸劑、納米顆粒、脂質體）中的重要屬性，本研究重點考察了藥物粒徑對長效注射混懸劑在體外和體內釋放特性的影響。
正如預期的那樣，藥物的粒徑顯著影響了體外和體內的釋放曲線。粒徑越大，在體內外的藥物釋放速率越慢。F1，F2，F4和RLD的體內與體外釋放顯示出相同的次序（圖3CD）。但是F3并沒有遵循相同的規律，它的粒徑最小，預計在體內釋放最快，相反，F3在體內藥物釋放最緩慢。進一步的研究表明，F3在體外并不穩定，室溫下隨著時間的推移容易發生聚集，其粒徑（Dv50）在5天的時間內一直增加到20 μm左右（圖4A）。此外，F3的跨度值也從2.61下降到1.5以下 (圖4B），表明F3的粒徑分布隨著時間的推移而變窄。因此，F3顆粒在注射部位的聚集是造成體內釋放緩慢的重要原因之一。此外，也有可能F3在體內快速溶解，然后在注射部位沉淀或再結晶，形成了更大粒徑的顆粒，從而減緩藥物釋放。由于建立IVIVC的最基本原則是體外和體內的結果應一致，因此F3并未包括在體內外相關性的研究中。
通過調整藥物粒徑（F1、F2和F3）和改變PEG 3350的賦形劑來源（F1和F4），制備了具有不同釋放速率的MPA混懸劑，雖然使用完全相同的懸浮介質，但藥物顆粒不一定具有物理穩定性，以探針超聲法制備的F3為例，在常溫常壓條件下粒徑隨時間增長，初始粒徑（Dv50）約為3μm，到第5天粒徑約為20μm。在體外釋放試驗中并未觀察到粒徑的變化，這很可能是因為在漏槽條件下釋放介質具有稀釋效應，但在兔體內釋放實驗中觀察到藥物顆粒的聚集效應。這些結果說明了不同的工藝條件可以影響粒子的穩定性，所以在不同工藝條件下制備混懸劑是具有挑戰性的，表明了精確控制長效注射混懸劑粒徑的重要性。
3.3 MPA混懸劑的IVIVC研究
根據之前關于MPA混懸劑釋放測試方法開發的報道，使用帶浸沒池的USP裝置二（圖3C）和帶半固體適配器的USP裝置四（圖3D）顯示出良好的釋放特性，可以嘗試建立A級IVIVC。使用兩種裝置可獲得較長時間釋放曲線 (至少一周），具有可接受的再現性和區分不同粒徑MPA混懸劑的能力。在A級IVIVC的研究中，理想情況是體內釋放部分與體外溶出部分之間有1:1的關系。如果體外釋放持續時間接近制劑的體內療效持續時間，則有可能建立無時間縮放和轉換或最小時間縮放和轉換的IVIVC。與目前FDA推薦的用于其他長效注射混懸劑產品的方法（30分鐘至2天）相比，這兩種方法體外釋放持續時間長得多（USP裝置二為2周，USP裝置四為1周），但仍比體內療效持續時間（3個月）短得多（圖3CD）。
使用WinNonlin IVIVC工具包進行MPA混懸劑的IVIVC研究，將體外數據與所選制劑的體內釋放數據進行比較。
3.3.1 使用USP裝置二（帶浸沒池）獲得的體外釋放數據
首先，從帶浸沒池的USP裝置二中獲得了四種制劑F1， F2， F4和RLD的體外數據。F2、F4和RLD作為體內制劑，F1作為體外制劑，采用雙Weibull模型擬合效果最佳。通過縮放和移位的方法，吸收分數和釋放分數之間的IVIVC線性回歸擬合系數（R2值）為0.9377（圖5A）。使用建立的IVIVC將預測與觀察到F1在體內的釋放情況進行比較（圖5B）。結果表明兩條曲線在一些時間間隔內重疊，但在其他時段具有明顯的區別。
吸收比例因子（scaling factor for absorption）和時間比例因子（scaling factor for time）分別為0.91和0.17，時移因子（time shifting factor）為0.31。IVIVC驗證總結如表3所示。對于體內預測性，AUC的%PE符合標準（個體%PE＜15%，平均%PE＜10%），但Cmax的%PE＞10%。因此使用USP裝置二（帶浸沒池）獲得的體外釋放數據并不能建立A級IVIVC
3.3.2 使用USP裝置四（帶半固態適配器）獲得的體外釋放數據
使用USP裝置四方法獲得體外釋放數據，選擇三種或四種制劑用于IVIVC的研究。
3.3.2.1 三種制劑（F1、F4和RLD）
F1和RLD作為體內制劑，F4作為體外制劑，Hill和Weibull模型均較好地擬合了體外釋放曲線，僅使用縮放方法就能建立和驗證IVIVC。Hill和Weibull模型的IVIVC線性回歸擬合系數（R2值）分別為0.9586和0.9599（圖6A和6C）。通過建立的IVIVC對F4制劑的體內釋放曲線進行預測和觀察，除了曲線末端的幾個時間點外均顯示出良好的一致性 (圖6B和6D)。采用Hill和Weibull模型，吸收比例因子（scaling factor for absorption）分別為0.91和0.93，時間比例因子（scaling factor for time）均為0.06。表4通過體外釋放數據的Hill和Weibull模型對IVIVC驗證進行了總結。對于不同的模型，IVIVC的預測性略有差異，比如使用Hill和Weibull模型，由于F1制劑Cmax的%PE絕對值較高，體內預測性是不準確的。但對于AUC和Cmax，體外預測性的%PE均在10%以內（Hill模型：AUC和Cmax的%PE分別為-9.81%和7.67%；Weibull模型：AUC和Cmax的%PE分別為- 8.61%和-9.76%）。根據FDA關于IVIVC緩釋片口服劑型申請指南，當體內預測性不準確時，若體外預測性的AUC和Cmax的%PE絕對值均小于10%，可采用體外預測性進行IVIVC的評價。因此，使用F1、F4和RLD三種制劑成功建立了A級IVIVC，并使用USP裝置四獲得了體外釋放數據。
3.3.2.2 四種制劑（F1、F2、F4和RLD）
F1、F2和RLD作為體內制劑，F4作為體外制劑。使用Hill和Weibull模型均可獲得擬合度高的體外釋放曲線。但使用Hill模型擬合的體外數據獲得IVIVC體外預測性的%PE值略超出標準（AUC的%PE值為-9.49%，Cmax的%PE值為12.26%)。因此，在IVIVC建立過程中選擇Weibull模型進行體外釋放數據進行建模，建立IVIVC并使用縮放方法進行驗證。使用F1、F2和RLD，吸收和釋放分數之間的線性回歸擬合系數（R2值）為0.9664(圖7A)。觀察和由IVIVC預測的體內曲線在多數時間段有重疊（圖7B）。吸收和時間比例因子分別為0.92和0.06。IVIVC驗證總結如表5所示。與使用三種制劑建立的IVIVC類似，F1和F2 %PE絕對值較高，體內預測性不確定。但AUC（-9.07%）和Cmax（-5.06%）的%PE均在體外預測性的誤差范圍內（10%）。因此，使用四種MPA混懸劑和從USP裝置四獲得的體外釋放數據成功建立了A級IVIVC，并且比較了四種制劑預測和觀察到的PK曲線（圖8）。由于Cmax的 %PE絕對值高，低估了F1和F2的Cmax預測值。相反，F4和RLD的Cmax預測值與觀察到的Cmax顯示出良好的一致性。由于目前關于長效注射混懸劑的IVIVC研究文獻報道很少，這類制劑的Cmax中%PE較高的原因尚不清楚，預測誤差較大可能是因為：（1）建模所用的數據為平均值，Cmax值可能發生偏移；（2）體外與體內釋放條件有很大區別，而且要同時考慮到給藥過程中對制劑產生的全部生理及生物學效應很難做到；（3）隨著時間的推移，制劑可能在注射部位發生變化，例如沉淀、再結晶和聚集。
3.4 IVIVC研究的考慮因素
3.4.1 體外釋放模型
本研究使用三種不同的模型（Hill、Weibull和雙Weibull）進行體外釋放曲線的數據分析。USP裝置二獲得的釋放曲線在使用雙Weibull模型時擬合最佳，而USP裝置四獲得的釋放曲線在使用Hill和Weibull模型時擬合最佳。在通過三種制劑（F1、F4和RLD）研究IVIVC的過程中，使用USP裝置四和Hill或Weibull模型成功建立了A級IVIVC。但通過四種制劑（F1、F2、F4和RLD）研究IVIVC時，只有使用Weibull模型擬合體外數據才能建立A級IVIVC，因此選擇合適的模型對IVIVC研究至關重要。
3.4.2 體內釋放數據和IVIVC研究
FDA指南并未規定建立IVIVC所需要的方法，只要所用模型在不同的IVIVC類別下具有可接受的%PE即可。通過IVIVC開發的長效注射混懸劑均能滿足所有制劑的AUC標準（個體%PE<15%）。但是一些體內和體外制劑Cmax的%PE絕對值高，導致通過USP裝置二無法建立A級IVIVC。相比之下，盡管USP裝置四的體內預測性不準確，但仍成功建立了A級IVIVC。
這是關于長效注射混懸劑臨床前（兔模型）IVIVC研究的第一份報告。通過USP裝置四使用三種或四種制劑獲得了體外釋放數據，成功建立了A級IVIVC。由于制劑的Cmax的預測誤差值較高，不能使用USP裝置二獲得的體外數據來建立IVIVC，因此在長效注射混懸劑的體外釋放方法開發過程中，出于產品質量控制和IVIVC研究的目的，可以優先考慮USP裝置四方法。藥物粒徑顯著影響體外和體內釋放過程，被認為是長效注射混懸劑開發中的一個關鍵質量屬性。體外釋放模型的選擇（Hill、Weibull和雙 Weibull等）可能會改變IVIVC建立的最終結果，因此在數據分析中必須仔細考慮。所建立的IVIVIC將為長效注射混懸劑的處方篩選和優化，以及體外釋放方法研究提供科學依據。
略
