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翻譯：華溶應(yīng)用中心
審核：工業(yè)藥劑發(fā)燒友
Amp B是兩性霉素B的脂質(zhì)體制劑，這是一種復(fù)雜的胃腸外抗真菌藥物，迄今為止尚未獲得美國食品及藥物管理局批準(zhǔn)的仿制藥版本。對(duì)于通用Amp B脂質(zhì)體產(chǎn)品開發(fā)，藥物釋放曲線的檢查對(duì)于產(chǎn)品質(zhì)量控制和與列出的參比藥物的分析可比性評(píng)估非常重要。然而，目前尚無Amp B脂質(zhì)體的標(biāo)準(zhǔn)化體外藥物釋放（IVR）試驗(yàn)。在本研究中，我們描述了基于USP-4流池法溶出儀的IVR試驗(yàn)的開發(fā)，該試驗(yàn)?zāi)軌蚋鶕?jù)藥物釋放譜鑒別Amp B脂質(zhì)體注射劑。IVR試驗(yàn)開發(fā)的目標(biāo)是確定釋放介質(zhì)組成和試驗(yàn)溫度，能夠在24h內(nèi)促進(jìn)Amp B脂質(zhì)體70-100%的藥物釋放，而不會(huì)出現(xiàn)Amp B沉淀或脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)破壞。我們發(fā)現(xiàn)，在5%蔗糖、10% mM HEPES和0.01% NaN3（pH為7.4）的釋放介質(zhì)中添加5% w/v β -環(huán)糊精可防止Amp B沉淀并促進(jìn)藥物釋放。IVR分析溫度的增加導(dǎo)致藥物釋放速率的增加，故選擇55°C作為在不引起樣品沉淀的情況下促使藥物釋放達(dá)到溶出平臺(tái)的最高溫度。所開發(fā)的IVR試驗(yàn)用于區(qū)分Amp B脂質(zhì)體和Amp B膠束產(chǎn)品（如Fungizone?和Fungcosome）的藥物釋放速率。IVR試驗(yàn)還能夠區(qū)分與AmBisome?成分相同但通過擠出或均質(zhì)工藝制備的Amp B脂質(zhì)體，這兩種工藝均導(dǎo)致可測(cè)量的脂質(zhì)體粒度異質(zhì)性和Amp B濃度差異。最后，使用USP-4 IVR分析比較了Amp B與印度批準(zhǔn)的兩種仿制藥Amphonex?（Bharat Serum and Vaccines Ltd.）（f2為66.3）和Phosome?（Cipla Ltd.）（f2為55.4）之間的Amp B釋放曲線。總之，所開發(fā)的USP-4 IVR測(cè)定法可作為仿制藥Amp B脂質(zhì)體制劑開發(fā)中藥物釋放圖譜表征的有用工具。
兩性霉素B脂質(zhì)體注射劑
體外藥物釋放試驗(yàn)
USP-4流池法溶出儀
仿制藥產(chǎn)品特性
AmBisome@是兩性霉素B的脂質(zhì)體制劑，于1997年首次進(jìn)入美國市場(chǎng)。目前，它是許多侵襲性真菌感染和內(nèi)臟利什曼病或血液惡性腫瘤患者接受化療和器官或同種異體骨髓移植時(shí)最廣泛使用的治療方法。AmBisome@的年銷售量超過3.5億，2016年美國專利到期，是仿制藥的主要目標(biāo)。然而，對(duì)于所有復(fù)雜注射給藥制劑，開發(fā)Amp B脂質(zhì)體注射劑仿制藥一直具有挑戰(zhàn)性。難點(diǎn)在于，對(duì)于AmBisome@等藥物而言，不僅是產(chǎn)品成分，工藝制造步驟也會(huì)顯著影響產(chǎn)品的整體功效和安全性。由于Amp B在水溶液中的溶解性差，并且需要在脂質(zhì)體雙層中與二硬脂酷磷脂酷甘油(DSPG)進(jìn)行AmpB絡(luò)合，因此AmBisome@生產(chǎn)工藝相當(dāng)精細(xì)。為確保Amp B脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，為該產(chǎn)品選擇的脂質(zhì)混合物必須具有高相變溫度，因?yàn)樵S多生產(chǎn)步驟必須在高達(dá)65°C的溫度下進(jìn)行。此外，AmBisome@的平均脂質(zhì)體粒度相當(dāng)小(小于100nm)，多分散性低，需要高度控制粒度減小，以實(shí)現(xiàn)自制制劑和參比制劑之間的特性匹配
此外，產(chǎn)品的許多理化特性決定了AmpB在體內(nèi)的釋放速率，這與動(dòng)物和人類的毒性直接相關(guān)。這些產(chǎn)品質(zhì)量特性包括薄膜中Amp B的物理狀態(tài)、脂質(zhì)體粒度均勻性、脂質(zhì)體相變溫度和未包封藥物的量。為確保實(shí)現(xiàn)所需的產(chǎn)品特性，幾個(gè)Amp B脂質(zhì)體生產(chǎn)步驟至關(guān)重要。這些工藝參數(shù)包括:有機(jī)相中脂質(zhì)體組分濃度、有機(jī)相組成、組分混合順序、均質(zhì)條件和產(chǎn)品凍干參數(shù)。
雖然已有幾個(gè)AmpB脂質(zhì)體仿制藥在美國境外獲得批準(zhǔn)，但由于產(chǎn)品安全問題，許多產(chǎn)品相繼撤出市場(chǎng)。其中兩種產(chǎn)品是最初在阿根廷獲批的Anfgen@ (GenpharmaS.A.)和最初在印度獲批的Lambin@ (Sun Pharmaceutical Industries) 。當(dāng)將Anfgen@和Lambin@與AmBisome@進(jìn)行比較時(shí)，基于LD-50值，這兩種仿制藥對(duì)小鼠的毒性是前者的2-10倍，并且在肺曲霉病小鼠模型中顯示出較低的療效。這兩種仿制產(chǎn)品的處方組成與AmBisome?完全相同，仿制產(chǎn)品的功效和安全性的差異歸因于AmpB的快速釋放。因此，開發(fā)能夠區(qū)分Amp B脂質(zhì)體制劑的體外藥物釋放方法至關(guān)重要
最近，一些基于體外釋放的IVR檢測(cè)方法已用于表征多種特殊制劑如混懸液、聚合物微球和脂質(zhì)體的釋放特性， 與傳統(tǒng)的“透析袋”和“樣品和分離”的方法相比，這些VR分析具有一些顯著的優(yōu)勢(shì)，包括使用標(biāo)準(zhǔn)USP-4溶出度儀、針對(duì)不同釋放條件易于調(diào)節(jié)參數(shù)、無需采樣的自動(dòng)藥物檢測(cè)以及無外部干擾的閉環(huán)系統(tǒng)。可通過升高溫度和在釋放介質(zhì)中添加增溶劑的情況下對(duì)復(fù)雜注射給藥制劑進(jìn)行USP-4溶出試驗(yàn)，以促進(jìn)活性藥物成分(AP)從高度穩(wěn)定的脂質(zhì)體、微球或混懸制劑中釋放。所有這些優(yōu)勢(shì)將極大地有助于建立一種穩(wěn)定且可重復(fù)的AmpB脂質(zhì)體制劑的IVR檢測(cè)方法。
我們?cè)谶@里介紹了使用USP-4溶出儀進(jìn)行AmpBIVR分析的開發(fā)，該溶出儀能夠區(qū)分AmpB脂質(zhì)體和其產(chǎn)品的相似處方，這些產(chǎn)品的組成與AmBisome@相同，但表現(xiàn)出不同的AmpB釋放速率。將幾種增溶劑添加到釋放介質(zhì)中，并篩選它們?cè)诓涣⒓雌茐闹|(zhì)體結(jié)構(gòu)的情況下提高AmpB溶解度和釋放速率的能力。調(diào)節(jié)釋放介質(zhì)中的IVR分析條件(如溫度、藥物濃度和增溶劑濃度)，以確保AmBisome@24h內(nèi)釋放超過70%的Amp B。IVR試驗(yàn)用于評(píng)估AmBisome@與兩種仿制藥Amphonex@ (Bharat Serumand Vaccines Ltd.)和Phosome@ (Cilpa Ltd)之間Amp B釋放速率的相似性，這兩種仿制藥目前在印度銷售。 其他基于膠束的制劑，如Fungizone@ (X-GenPharmaceuticals，F(xiàn)DA批準(zhǔn))和Fungcoome (上海新亞藥業(yè)，中國批準(zhǔn))，使用我們的方法表現(xiàn)出明顯不同的釋放速率。此外，在已建立的USP-4IVR試驗(yàn)中，使用與AmBisome@生產(chǎn)工藝不同的方法在內(nèi)部制備的AmpB脂質(zhì)體制劑(導(dǎo)致粒度分布略有不同)也表現(xiàn)出與AmBisome@相比不同的釋放速率。我們還評(píng)估了USP-4IVR是否能夠通過檢查AmBisome@樣品強(qiáng)制降解釋放的藥物來提供穩(wěn)定性信息。 總之，建立的USP-4IVR測(cè)定可用于質(zhì)量控制，以指導(dǎo)仿制藥Amp B脂質(zhì)體制劑的開發(fā)和仿制藥的分析可比性測(cè)試。
2.1、 材料
AmBisome?（安斯泰來制藥股份有限公司）和Fungizone?（X-Gen制藥公司）從密歇根大學(xué)醫(yī)院藥房購買，兩性霉素B（Amp B）、γ-環(huán)糊精（γ-CD）、羥丙基環(huán)糊精（HP - CD）和Fungcosome購自SHJNJ Pharmatech（中國上海）， Amp B參比標(biāo)準(zhǔn)品購自USP（Rockville，MD），Amphonex?和Phoso ?由Bharat Serum and Vaccines Ltd. （印度孟買）提供。DSPG和HSPC購自Lipoid (Newark, NJ)，膽固醇購自AvantiPolar脂類公司（Alabaster，Alabama），F(xiàn)loor-A-Lyzer ?透析管的分子量截止值為300kDa，購自美國加利福尼亞州蘭喬多明格斯光譜實(shí)驗(yàn)室。蔗糖購自Fluka，十二烷基硫酸鈉（SDS）、異丙醇、HEPES、α -生育酚、NaN3和所有其他試劑均購自西格瑪。為確保定量分析的準(zhǔn)確性，本研究中使用的所有緩沖液均在使用前制備。
2.2、方法
2.2.1. Amp B脂質(zhì)體的制備
脂質(zhì)體 (35:20-8; 35:41-4; 35:48-7）基于NeXstar的公開專利，并進(jìn)行了一些修改。 首先，將33.6mg DSPG、85.2mg HSPC、20.8mg膽固醇和0.256mgα-生育酚加入含14.0μL水（2% v/v）的1mL乙醇中，加熱至65°C，并攪拌溶解脂質(zhì)。 將溶于0.3 mL DMSO中的20mg Amp B預(yù)熱至65°C，并添加到脂質(zhì)溶液中。將2.6 mL的70°C預(yù)加熱緩沖液（10mM琥珀酸鈉，10%（w/v）蔗糖，pH 4.8）加入Amp B/脂質(zhì)溶液中，在70°C下間歇攪拌15分鐘，并冷卻至室溫。在4°C下用緩沖液（10 mM琥珀酸鈉，10%（w/v）蔗糖，pH 4.8）透析混懸液，并進(jìn)行兩次凍融循環(huán)。Amp B的目標(biāo)濃度為0.7 mg/mL，以避免過濾時(shí)堵塞膜孔。將混懸液使用200nm聚碳酸酯膜過濾一次和80nm聚碳酸酯膜過濾七次，以獲得最終的Amp B脂質(zhì)體處方35:20-8。
將252 mg DSPG和150 mg Amp B加入7.5 mL MeOH/DMSO（7/2，v/v）中，加熱至65°C，并加入150 μL H2O（2%，v/v）和124 μL 2.5M HCl，制備處方35:41-4。 將混合物在65°C下加熱攪拌，直至所有組分溶解，并觀察到透明橙色的DSPG/Amp B溶液。將639 mg HSPC、156 mg膽固醇和1.92 mg α-生育酚等其他脂質(zhì)體組分在7.5 mL MeOH/DMSO（7/2，v/v）中，在65℃下溶解5min。將兩種制備的溶液混合，并在65°C下再放置10min，然后加入73μL 2.5M NaOH。 在恒溫65°C的夾套攪拌容器中，將脂質(zhì)溶液加入到135 mL預(yù)加熱緩沖液（10mL琥珀酸鈉，10%蔗糖（w/v），pH 4.8）中，迅速攪拌15min后，冷卻后，用十倍體積的緩沖液（10mM琥珀酸鹽，10%蔗糖（w/v），pH5.5）置換，并通過切向流過濾濃縮至4mg/mL Amp B。 使用M-110P型微流化器（馬薩諸塞州韋斯特伍德微流化公司）對(duì)脂質(zhì)體混懸液進(jìn)行均質(zhì)處理，在10000 psi下處理七次，形成35:48-7，在20000 psi下處理四次，形成35:41-4。
2.2.2.Amp B脂質(zhì)體粒度分析
測(cè)量前，添加0.9 mL釋放介質(zhì)或去離子水稀釋0.1 mL Amp B脂質(zhì)體，通過使用Malvern Instruments ZetaSizer 3000HSa（馬薩諸塞州韋斯特伯勒）動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定室溫下的平均粒徑和多分散性。對(duì)于Amp B膠束制劑，在不稀釋的情況下分析樣品。所有樣品重復(fù)分析三次。
2.2.3.高效液相色譜法分析Amp B濃度
采用配備UV檢測(cè)器的高效液相色譜 (HPLC) 測(cè)量不同制劑中的Amp B濃度。 使用Higgins PROTO 300 C18柱（250×4.6 mm，5μm，Higgins Analytical Inc.，Mountain View, California）在室溫下進(jìn)行色譜分離。 流動(dòng)相由 (A) 含0.1% v/v三氟乙酸的甲醇和 (B) 含0.1% v/v三氟乙酸的水組成，濃度梯度為60-84% A，運(yùn)行時(shí)間9分鐘，流速為1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為390 nm。將Amp B參比標(biāo)準(zhǔn)品溶于二甲基亞砜中，形成貯備液（4mg/mL），用甲醇稀釋至80μg/mL，對(duì)于所有Amp B制劑，將100 μL樣品溶于1mL DMSO中，然后用甲醇稀釋至5mL。在高效液相色譜分析之前，所有樣品在12000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心10min，并根據(jù)峰面積使用外標(biāo)法計(jì)算不同制劑中的Amp B濃度。
2.2.4.基于單瓶樣品IVR分析AmBisome?釋放條件篩選
對(duì)于釋放介質(zhì)組成的選擇，將AmBisome?置于浸沒在38.4 mL釋放介質(zhì)中的Float-A-Lyzer?（分子量截止值300 kDa）錐形離心管中，在單瓶的IVR分析中進(jìn)行釋放實(shí)驗(yàn)。簡(jiǎn)言之，用1.5 mL釋放介質(zhì)稀釋0.1 mL AmBisome?或游離Amp B（4mg/mL）貯備液，然后置于Float-alyzer ?中（釋放介質(zhì)中的最終Amp B濃度為10μg/mL），將溶液在45°C下保溫24h，并在180 rpm下振搖。所有考察實(shí)驗(yàn)的釋放介質(zhì)均由5%蔗糖、10mM HEPES和0.01% NaN3（pH為7.4）組成。考察了添加5% γ-CD、5% HP-CD、0.25% SDS或10% IPA對(duì)Amp B釋放速率的影響，取0.1mL 4mg/mL的游離Amp B貯備液直接加入39.9 mL釋放介質(zhì)中作為對(duì)照品（10μg/mL）。以預(yù)定時(shí)間間隔取出溶出介質(zhì)等分試樣（300 μL），并用新鮮釋放介質(zhì)代替。 使用Synergy Neo HTS多模式微孔板讀數(shù)器（BioTek儀器公司，VT，美國），通過414 nm的紫外吸光度測(cè)定不同時(shí)間釋放的Amp B量。
為了考察單瓶IVR試驗(yàn)中釋放條件對(duì)Amp B釋放性能的影響，在45 ℃、55 ℃和60 ℃的溫度下進(jìn)行了釋放研究。為了考察增溶劑濃度對(duì)Amp B釋放的影響，測(cè)試了γ- CD1、2.5、5和10% (w/v) 的濃度。在總釋放介質(zhì)中，采用不同的Amp B初始濃度5μg/mL、10μg/mL和30μg/mL進(jìn)行IVR分析，其他釋放條件和實(shí)驗(yàn)步驟與上文所述相同。
如前所述，使用DLS分析比較了AmBisome?釋放前后的平均粒徑和PDI。在釋放介質(zhì)中稀釋樣品，并通過三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)獲得平均粒徑。
2.2.5.建立用于區(qū)分AmBisome?和其他Amp B 處方制劑的USP-4 IVR檢測(cè)方法
使用USP-4溶出儀（推薦使用華溶DS-7CP流池法溶出系統(tǒng)）檢查了AmBisome?或其他Amp B處方制劑的Amp B釋放情況。簡(jiǎn)言之，將含有樣品的1.6 mLAmBisome?或其他Amp B處方制劑置于Float-A-Lyzer ?中（試管中的Amp B濃度等于0.5 mg/mL），然后插入U(xiǎn)SP-4流通池中，每個(gè)池體添加78.4 mL釋放介質(zhì)（Amp B的最終濃度為10μg/mL），將溶媒以16mL/min的閉環(huán)管路填充，并保持在55°C，通過紫外線吸收檢測(cè)Amp B每小時(shí)的釋放量。在方法開發(fā)階段，將等量游離Amp B溶液（10μg/mL）直接與釋放介質(zhì)混合作為對(duì)照，以模擬Amp B從制劑中完全釋放，并用紫外吸光光度法檢測(cè)Amp B在釋放期間的變化。 通過將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)釋放的AmBisome?或其他Amp B處方制劑釋放的Amp B量除以Amp B對(duì)照溶液的釋放量，計(jì)算累積釋放量（%）。所有實(shí)驗(yàn)中的釋放量均一式三份，結(jié)果報(bào)告為平均值±SEM。
通過此方法測(cè)試的Amp B處方制劑包括：(A) Micelle Amp B處方（Fungizone?, X-Gen Pharmaceuticals, Inc.美國）；(b) Fungcosome，由中國上海新亞藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的混合膠束制劑；（C）具有與AmBisome?相同成分的通用Amp B脂質(zhì)體制劑，如Amphonex?（巴拉特血清和疫苗有限公司）和Phosome?（Cilpa有限公司）；（d）Amp B脂質(zhì)體制劑，其組成與通過均質(zhì)（35:41-4和35:48-7）或擠出（35:20-8）制備的AmBisome?相同。
使用以下公式進(jìn)行f2測(cè)試，以比較AmBisome?和其他Amp B處方制劑的累積釋放是否存在顯著差異。
變量如下：n是時(shí)間點(diǎn)的數(shù)量，Rt是參比產(chǎn)品在時(shí)間點(diǎn)t (t>0) 的累積釋放值，Tt是測(cè)試批次在同一時(shí)間點(diǎn)的累積釋放值。 所有時(shí)間點(diǎn)的累積釋放值（n=24）用于計(jì)算f2。 相似因子f2≥50的試驗(yàn)制劑被認(rèn)為與參比制劑相似。如果 f2值為100，表明測(cè)試曲線和參比曲線相同，并且隨著值變小，釋放曲線之間的差異會(huì)增加。
2.2.6.驗(yàn)證USP-4流池法溶出儀IVR測(cè)定是否具備穩(wěn)定性
瓶裝AmBisome?根據(jù)生產(chǎn)說明進(jìn)行水合處理，冷藏儲(chǔ)存最長(zhǎng)達(dá)七個(gè)月。 采用USP-4 IVR法對(duì)老水化樣品和新水化樣品進(jìn)行分析，并計(jì)算f2值。此外，將水合AmBisome?等分試樣在60°C下保溫七小時(shí)、三天和七天。對(duì)強(qiáng)制降解樣品和非強(qiáng)制降解樣品進(jìn)行了體外循環(huán)試驗(yàn)，并計(jì)算了f2值。
3.1.增溶劑對(duì)單瓶AmBisome?釋放的影響
由于Amp B的水溶性較差，必須向釋放介質(zhì)中添加增溶劑，以確保下沉條件。 此外，通常在復(fù)合注射給藥制劑的釋放介質(zhì)中增溶劑，以促進(jìn)活性藥物成分 (API) 的釋放。 例如，在USP-4 IVR試驗(yàn)中，使用羥丙基環(huán)糊精溶解多柔比星并促進(jìn)其從Doxil?中釋放，同時(shí)添加乙腈和乙醇以促進(jìn)依維莫司和左炔諾孕酮聚合物微球制劑的藥物釋放。為了快速篩選多種增溶劑，在45°C和振搖的條件下，在單瓶AmBisome?釋放試驗(yàn)中進(jìn)行了IVR分析。 為確保增溶劑的添加不會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)體破壞，在放行研究結(jié)束時(shí)測(cè)量了AmBisome?的粒度。 當(dāng)使用5% HP - CD或10% IPA作為增溶劑時(shí)，在釋放介質(zhì)中觀察到Amp B沉淀（圖1 a, b）。 由于Amp B沉淀，Amp B在釋放介質(zhì)（線C）中的總吸光度顯著低于Amp B在添加0.25% SDS（圖1c）或5% γ-CD（圖1d）的介質(zhì)中的總吸光度。 添加0.25%SDS可更快地釋放AmBisome?（A線），但AmBisome?（A線）的粒度從119nm減小到23nm（表1），表明表面活性劑破壞了脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。 此外，從Float-A-Lyzer ?中釋放的游離Amp B在含有0.25%SDS的介質(zhì)中緩慢且達(dá)不到平臺(tái)（B線），表明Amp B可能溶解在緩慢透過300 kDa膜的SDS膠束中。當(dāng)將0.5% (w/v) SDS添加到地塞米松脂質(zhì)體的釋放介質(zhì)中時(shí)，Bhardwaj等人觀察到脂質(zhì)體的類似結(jié)構(gòu)破壞以及脂質(zhì)體含量的立即釋放。與SDS不同的是，在釋放介質(zhì)中加入5%的γ-CD，使游離Amp B溶液從Float-A-Lyzer ?中快速完全釋放（圖1d）。添加5%的γ-CD僅導(dǎo)致AmBisome?粒度微小增加，并允許24.2%的藥物在45°C下24h內(nèi)釋放（圖1d）。在5% γ-CD溶媒中進(jìn)行IVR分析發(fā)現(xiàn)AmBisome?平均粒徑從118nm增加至123nm，表明脂質(zhì)體在藥物釋放試驗(yàn)期間保持完整（見表1）。基于該數(shù)據(jù)，選擇γ-CD作為Amp B增溶劑，并進(jìn)行了額外的IVR分析優(yōu)化研究，以提高脂質(zhì)體的藥物釋放速率。
圖1. 在45°C條件下，單瓶裝AmBisome?試驗(yàn)中，增溶劑添加到釋放介質(zhì)中對(duì)Amp B釋放的影響，包括5% HP-CD（a）、10% IPA（b）、0.25% SDS（c）或5% γ-CD（d）。曲線代表：A.AmBisome?在 Float-A-Lyzer? (●)中；b. Float-A-Lyzer?中的游離Amp B溶液 (■)；C.釋放介質(zhì)中的游離Amp B (▲)。對(duì)于所有組，釋放介質(zhì)中的最終Amp B濃度為10μg/mL。
表1.不同釋放條件對(duì)AmBisome?穩(wěn)定性的影響
在釋放研究完成之前和之后，使用釋放介質(zhì)稀釋后，通過DLS測(cè)量粒徑。
3.2.通過IVR測(cè)定溫度、γ-CD濃度和Amp B濃度對(duì)單瓶AmBisome?釋放的影響
本研究的總體目標(biāo)是建立一種可在8-24小時(shí)內(nèi)釋放70-100%藥物的IVR試驗(yàn)。時(shí)間要求來自對(duì)IVR分析方法的實(shí)際需求，該方法將在分析實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行批量分析。從脂質(zhì)體制劑中釋放70-100%的原料藥，確保了IVR分析的鑒別能力，完全釋放后，更有可能確定不同制劑之間的藥物釋放速率，進(jìn)一步優(yōu)化測(cè)定條件，以提高單瓶IVR測(cè)定的Amp B釋放的完整性。通過差示掃描量熱法測(cè)定，AmBisome?在56°C時(shí)相變溫度較高，因?yàn)橹|(zhì)體由完全飽和的磷脂和膽固醇組成。為了提高復(fù)合脂質(zhì)體或聚合物微球產(chǎn)品的藥物釋放速率，IVR分析通常在接近或高于產(chǎn)品相變溫度下進(jìn)行。例如，Doxil?和Risperdal? Consta? USP-4釋放試驗(yàn)均在45°C下進(jìn)行。因此，為了提高Amp B的釋放速率，在含有5% γ- CD的釋放介質(zhì)中，在45 ℃、55 ℃和60 ℃下進(jìn)行IVR分析。如圖2a所示，溫度升高對(duì)AmBisome?的Amp B釋放有顯著影響，在45°C、55°C和60°C下分別有35%、76%和98%的累積藥物釋放。IVR分析溫度的升高對(duì)Float-A-Lyzer ?中游離Amp B溶液的擴(kuò)散速率沒有影響（圖2b）。當(dāng)分析溫度高達(dá)60°C時(shí)，AmBisome?的粒度適度增加，并觀察到產(chǎn)品沉淀（見表1），表明AmBisome?在這種高溫下不穩(wěn)定。因此，選擇55°C IVR分析溫度進(jìn)行后續(xù)研究。
圖2. 在不同釋放溫度下，通過單瓶的IVR分析，從Float-A-Lyzer ?中釋放AmBisome?（a）和游離Amp B（b）。添加5% γ-CD到溶媒中，所有實(shí)驗(yàn)的總Amp B濃度為10μg/mL。
圖3. 在55°C下，通過單瓶的IVR分析，在不同γ - CD濃度下從Float-A-Lyzer ?中釋放AmBisome?（a）和游離Amp B（b）。所有實(shí)驗(yàn)的總Amp B濃度均為10μg/mL。
為了研究釋放介質(zhì)中γ-CD濃度對(duì)脂質(zhì)體累積Amp B釋放的影響，我們?cè)卺尫沤橘|(zhì)中添加1%、2.5%、5%或10% γ-CD (w/v) 進(jìn)行了研究（圖3），所有實(shí)驗(yàn)均在55°C下進(jìn)行。添加1% γ-CD后，從Float - A-Lyzer ?中釋放游離Amp B溶液的速度緩慢且不完全，表明藥物在1% γ-CD中的溶解度有限（圖3b）。對(duì)于其他 γ-CD濃度，F(xiàn)loat-A-Lyzer ?中游離Amp B溶液的釋放迅速且完全。 我們觀察到隨著 γ-CD濃度的增加，AmBisome?的藥物釋放速率逐漸增加（圖3a）。這可能是由于Amp B通過 γ- CD與脂質(zhì)體表面膽固醇結(jié)合而增加了溶解度。膽固醇的去除可有效提高脂質(zhì)體的流動(dòng)性，降低有效相變溫度，從而加快Amp B的釋放，降低脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。在建立基于USP-4的Doxil? IVR分析之前，我們已經(jīng)觀察到這種效應(yīng)，在釋放介質(zhì)中添加10% γ-CD時(shí)，這種現(xiàn)象最為明顯，24h釋放后AmBisome?粒度從118.9nm顯著增加到264.1nm（表1），表明脂質(zhì)體可能聚集。由于釋放研究期間AmBisome?粒度顯著增加，后續(xù)研究中未使用10% γ-CD。在最終IVR試驗(yàn)中，選擇了5%（w/v）γ-CD作為溶媒組分，以確保在試驗(yàn)期間藥物釋放相對(duì)完整，而不會(huì)出現(xiàn)脂質(zhì)體聚集。
通過調(diào)整Float-A-Lyzer?中脂質(zhì)體的體積，研究了Amp B濃度對(duì)AmBisome?累積釋放的影響。為了在5μg/mL、10μg/mL和30μg/mL的釋放介質(zhì)中達(dá)到最終的理論Amp B濃度（假設(shè)藥物釋放率為100%），將0.05、0.1和0.3 mL的AmBisome?（4mg Amp B/mL）添加到Float-A-Lyzer?中，并使用80mL的釋放介質(zhì)。在所有濃度下僅觀察到24小時(shí)釋放的藥物量存在微小差異（圖4a），因此，所有后續(xù)研究均使用10μg/mL Amp B濃度，因?yàn)樗鼮獒尫潘幬锏淖贤饩€檢測(cè)提供了足夠的靈敏度，并為進(jìn)行IVR分析提供了最低要求的Amp B脂質(zhì)體量。
圖4.在55℃，5% γ-CD的條件下，通過單瓶IVR檢測(cè)不同Amp B濃度下Float-A-Lyzer?中AmBisome?(a)和游離Amp B (b)的釋放。
3.3.基于USP-4流池法溶出儀AmBisome?體外分析方法的優(yōu)化
根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在USP-4流池法溶出儀的基礎(chǔ)上對(duì)單瓶IVR分析中的優(yōu)化釋放條件進(jìn)行了調(diào)整。在閉環(huán)中于55°C下進(jìn)行IVR分析，溶媒以16mL/min的速度循環(huán)。最終釋放溶媒由5%蔗糖、10% mM HEPES、0.01% NaN3（pH為7.4）和5% γ-CD組成。將0.2 mLAmBisome?（4 mg/mL）與1.4 mL釋放介質(zhì)混合，將脂質(zhì)體或膠束置于最終濃度為0.5 mg/mL的Float-A-Lyzer?中，最后，在USP-4溶杯中加入78.4 mL溶媒，使釋放介質(zhì)中的最終Amp B濃度達(dá)到10μg/mL（假定藥物釋放率為100%）。
在USP-4 IVR試驗(yàn)裝置中，AmBisome?中Amp B的釋放與基于單瓶的IVR試驗(yàn)相似，24h內(nèi)約有75%的藥物釋放（圖5）。雖然選定的IVR條件為我們提供了區(qū)分Amp B各種脂質(zhì)制劑的機(jī)會(huì)，但該檢測(cè)存在一些明顯的局限性。該測(cè)定在高于正常生理?xiàng)l件和5%γ-CD受體存在下進(jìn)行，因此，IVR測(cè)得的釋放速率可能與Amp B體內(nèi)釋放速率不同。此外，已知AmBisome?在體內(nèi)給藥后與內(nèi)源性血漿脂蛋白相互作用，并被人體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吸收。需要指出的是，釋放藥物經(jīng)過透析膜后測(cè)得的Amp B濃度可能與Float-alyzer?內(nèi)脂質(zhì)體釋放的Amp B濃度不同，因?yàn)橥肝瞿な撬幬锏臄U(kuò)散屏障。Amp B從脂質(zhì)體中的實(shí)際釋放速率可以使用將Float-A-Lyzer?外部的實(shí)測(cè)藥物濃度與薄膜內(nèi)部的實(shí)際藥物濃度關(guān)聯(lián)起來的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行說明，正如Modi等人所做的那樣。
圖5. 在55°C下，不同商業(yè)Amp B制劑在Sotax?上的累積釋放。在溶媒中加入5% γ-CD，根據(jù)報(bào)告的包裝說明書藥物濃度，所有實(shí)驗(yàn)的Amp B總濃度為10μg/mL。
為了消除IVR測(cè)量AmBisome?中的Amp B緩慢釋放的可能性，主要是由于釋放的Amp B與脂質(zhì)體表面結(jié)合，在空白脂質(zhì)體存在的情況下測(cè)量了Float-A-Lyzer?中游離Amp B的釋放。AmBisome?制劑中使用的相同比例的HSPC、DPPG和膽固醇來制備空白脂質(zhì)體。空白脂質(zhì)體和游離Amp B分別以與AmBisome?成分相同的比例（模擬100%的藥物釋放方案-高濃度）和低10倍的Amp B量（模擬10%的藥物釋放方案-低濃度）混合（補(bǔ)充圖1）。在低藥物濃度下，不存在或存在空白脂質(zhì)體時(shí)均未觀察到Amp B釋放差異。在高藥物濃度下，在空白脂質(zhì)體存在的情況下，Amp B釋放稍慢（延遲≤1小時(shí)），但仍比AmBisome?的藥物釋放更快。總之，釋放的Amp B與脂質(zhì)體表面的結(jié)合對(duì)IVR測(cè)試性能的影響非常有限。在https://doi.org/10.1016/j.ejpb.2018.11.010的在線版本中，可以找到與本文相關(guān)的補(bǔ)充數(shù)據(jù)。
3.4通過USP-4 IVR測(cè)定比較AmBisome?和市售膠束Amp B制劑
對(duì)適用于USP-4流池法溶出儀的IVR試驗(yàn)進(jìn)行了區(qū)分脂質(zhì)體和膠束Amp B產(chǎn)品的能力測(cè)試。將脂質(zhì)體AmBisome?的藥物釋放與其他兩種Amp B上市產(chǎn)品的藥物釋放進(jìn)行了比較：由X-Gen Pharmaceuticals生產(chǎn)并在美國上市的膠束制劑Fungzione?，以及由上海新亞藥業(yè)有限公司在中國上市生產(chǎn)的膠束和脂質(zhì)體混合物Fungcosome。表2根據(jù)這些產(chǎn)品的包裝說明書總結(jié)了本手稿中使用的所有Amp B產(chǎn)品的成分。Fungizone?是一種由脫氧膽酸鈉和Amp B組成的膠束，在最初的6小時(shí)內(nèi)表現(xiàn)出極快的藥物釋放，累積藥物釋放接近100%（圖5）。Fungcosome囊體具有不同的組成，含有Amp B、脫氧膽酸鈉和磷脂酰膽堿的混合物，平均粒徑為653nm，相對(duì)Fungizone?囊體（180納米）和AmBisome?（102納米）大得多（表2）。盡管制劑不同，但在USP-4 IVR分析中，F(xiàn)ungcosome和Fungizone?的藥物釋放曲線相似，其特征是在6小時(shí)內(nèi)快速釋放達(dá)到穩(wěn)定。該釋放曲線表明，與脂質(zhì)體相比，F(xiàn)ungcosome微粒體更像混合膠束制劑。有趣的是，F(xiàn)ungcosome的Amp B釋放量未達(dá)到100%，這可能是由于用于USP-4試驗(yàn)的Amp B濃度4mg/mL（10mg/瓶，用2.5 mL 去離子水溶解）與我們使用高效液相色譜法測(cè)量的實(shí)際濃度2.8mg/mL之間存在差異。總之，這些結(jié)果表明USP-4方法能夠?qū)mBisome?與其他非Amp B脂質(zhì)體制劑區(qū)分開來。
表2. 與AmBisome?相比，不同Amp B制劑的組成、特性和釋放f2值
該處方在較低的目標(biāo)Amp B濃度下制備，以輔助擠出工藝。 在USP-4 IVR分析中，根據(jù)總釋放介質(zhì)中Amp B的目標(biāo)濃度10μg/mL進(jìn)行稀釋。
3.5 Amp B脂質(zhì)體制備方法對(duì)USP-4 IVR藥物釋放的影響
對(duì)于復(fù)雜的仿制產(chǎn)品，不僅成分，生產(chǎn)工藝也決定藥物釋放。通過均質(zhì)化或擠出工藝制備了三種不同的Amp B脂質(zhì)體制劑，以探討USP-4 IVR試驗(yàn)是否能夠區(qū)分它們的藥物釋放特性。所有脂質(zhì)體制劑均使用相同的藥物與脂類重量比為Amp B:HSPC:DSPG:膽固醇=50:213:84:52制備。將這些組分溶于酸化的甲醇-氯仿(50:50) 中，依次混合，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥成粉末。用乳糖緩沖液對(duì)粉末進(jìn)行水合并在65°C下攪拌，并將所得混懸液擠出或均質(zhì)以減小脂質(zhì)體粒度。使用Lipex擠出機(jī)在65°C下進(jìn)行擠出，得到粒徑分布窄、平均粒度為117.4 nm、PDI為0.116（表2）的Amp B脂質(zhì)體（35:20-8）。為避免擠壓濾芯堵塞，在低于AmBisome?4.0 mg/mL濃度的條件下，使用稀釋的Amp B脂質(zhì)混懸液（0.75 mg/mL）進(jìn)行擠壓。因此，測(cè)量樣品35:20-8中的最終Amp B濃度為0.74 mg/mL，并再次稀釋該制劑以進(jìn)行藥物釋放和粒度分析。另外兩種制劑在65°C、20000psi（35:41-4）或10000psi（35:48-7）下使用Microfluidics 110-PS均質(zhì)器均質(zhì)。當(dāng)使用低壓均質(zhì)化時(shí)，需要通過M-110P微流化器七次，以達(dá)到目標(biāo)脂質(zhì)體粒度，平均粒徑為88.6 nm，PDI為0.190（35:48-7）。當(dāng)脂質(zhì)體在高壓下均質(zhì)化時(shí)，需要四次才能達(dá)到目標(biāo)粒徑，并且脂質(zhì)體會(huì)再次具有不均勻的粒徑分布，平均粒徑為113.7 nm，PDI為0.26 (35:41-4) 。
脂質(zhì)體粒度分布的差異導(dǎo)致USP-4 Amp B釋放量有差異。通過均質(zhì)（35:48-7）制備的具有最小粒徑的非均質(zhì)脂質(zhì)體表現(xiàn)出最快的釋放速率，而通過擠出制備的具有較大粒徑的均質(zhì)脂質(zhì)體表現(xiàn)出較慢的Amp B釋放速率（35:20-8）（圖6）。與AmBisome?相比，我們制備的所有制劑均能更快地釋放Amp B，但計(jì)算出的用于評(píng)估釋放曲線相似性的f2值顯示，擠出脂質(zhì)體35:20-8與AmBisome?之間具有高度相似性，f2值為70.8。相反，通過均質(zhì)化制備的Amp B脂質(zhì)體的f2值低于50，被認(rèn)為與AmBisome?不同。除了生產(chǎn)工藝影響的脂質(zhì)體粒徑大小差異外，不能排除處方組分最終比例存在潛在差異的可能性。與Amp B濃度不同，未在最終產(chǎn)品中測(cè)量脂質(zhì)組分濃度，這在某種程度上限制了我們對(duì)藥物釋放結(jié)果的解釋。然而，這些數(shù)據(jù)表明，USP-4 IVR檢測(cè)對(duì)區(qū)分不同工藝制備的脂質(zhì)體制劑中Amp B的釋放非常敏感。
圖6. 不同Amp B脂質(zhì)體制劑的累積釋放量在55°C下在Sotax?上由Z1P擠出和均質(zhì)化制備而成。在介質(zhì)中加入5% γ-CD，所有實(shí)驗(yàn)的Amp B總濃度為10μg/mL。
3.6.通過USP-4 IVR測(cè)定AmBisome?的強(qiáng)制降解對(duì)Amp B釋放的影響
為了評(píng)估我們的AmBisome?含量測(cè)定是否獲得穩(wěn)定性信息，將水合AmBisome?樣品冷藏儲(chǔ)存七個(gè)月，并通過含量測(cè)定進(jìn)行檢驗(yàn)。與儲(chǔ)存的產(chǎn)品相比，藥物釋放略快，但f2計(jì)算值為63.4，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7a）。此外，水合AmBisome?樣品在60°C下經(jīng)受了八小時(shí)、三天和七天的強(qiáng)制降解，將強(qiáng)制降解的AmBisome?樣品中的Amp B釋放與實(shí)驗(yàn)前水合脂質(zhì)體中的藥物釋放進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，強(qiáng)制降解三天和七天的樣品釋放藥物的速度更快，計(jì)算的f2值分別為55.5和39.5（圖7a），然而，強(qiáng)制降解八小時(shí)的藥物釋放與非強(qiáng)制降解產(chǎn)品的釋放相似，f2值為94.5，表明AmBisome?產(chǎn)品具有較高的穩(wěn)定性。綜上所述，我們的IVR分析似乎是穩(wěn)定性指示性的，盡管輕度強(qiáng)制降解的AmBisome?樣品與非強(qiáng)制降解的AmBisome?樣品相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，因?yàn)閒2值通常超過50。缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性可能是由于AmBisome?的高穩(wěn)定性以及已建立的AmBisome?無法檢測(cè)到產(chǎn)品的微小差異。
圖7. 實(shí)驗(yàn)前水合AmBisome?、水合AmBisome?并儲(chǔ)存在2-8°C下七個(gè)月（a）和水合AmBisome?并儲(chǔ)存在60°C下八小時(shí)、三天和七天（b）的累積藥物釋放。 在55°C的條件下使用Sotax?進(jìn)行IVR測(cè)試。在介質(zhì)中加入5% γ-CD，所有實(shí)驗(yàn)的總Amp B濃度為10μg/mL。
此外，為了檢測(cè)IVR分析從破壞的脂質(zhì)體中區(qū)分藥物釋放的能力，我們?cè)贏mBisome?樣品中添加了10%SDS，從而將渾濁的脂質(zhì)體樣品轉(zhuǎn)化為粒徑小于等于100nm的脂質(zhì)-SDS- Amp B膠束澄清溶液（補(bǔ)充圖2）。隨后將AmBisome?與100:0、90:10、80:20、50:50和0:100比例的SDS裂解脂質(zhì)體混合，破壞的脂質(zhì)體和50:50混合物釋放藥物的速度非常快，但80:20、90:10混合物釋放Amp B的速度僅略快于完整的AmBisome?。缺乏差異可能是由于脂質(zhì)-SDS-Amp B膠束的形成，其也表現(xiàn)出Amp B的緩慢釋放。總之，強(qiáng)制降解研究和SDS加成研究的結(jié)果突出了開發(fā)的IVR測(cè)定方法在區(qū)分能力上的一些缺點(diǎn)，以及開發(fā)脂質(zhì)體產(chǎn)品的鑒別IVR測(cè)定的總體困難。
3.7.通過USP-4 IVR分析比較AmBisome?與在印度批準(zhǔn)的仿制藥
為了進(jìn)一步檢驗(yàn)USP-4 IVR試驗(yàn)的實(shí)用性，我們比較了AmBisome?和印度批準(zhǔn)的仿制藥Amp B脂質(zhì)體制劑釋放情況。雖然目前尚無FDA批準(zhǔn)的仿制藥Amp B脂質(zhì)體制劑，但全球已批準(zhǔn)多種仿制藥。幾年前，印度批準(zhǔn)了AmBisome?的仿制藥，其中一些仿制藥的成分相同，另一些仿制藥的成分略有不同。2016年，印度監(jiān)管機(jī)構(gòu)開會(huì)討論了與批準(zhǔn)的Amp B脂質(zhì)體制劑相關(guān)的安全性問題，并針對(duì)健康受試者的額外14天毒理學(xué)和單次低劑量藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)估提出了建議。 據(jù)我們所知，這一新的人體藥代動(dòng)力學(xué)可比性要求僅適用于由Bharat Serum and Vaccines Ltd.生產(chǎn)的Amphonex?和由Cipla Ltd.生產(chǎn)的Phosome?。因此，這兩種產(chǎn)品仍可在印度市場(chǎng)上銷售，本研究已采購這兩種產(chǎn)品。根據(jù)包裝說明書，Amphonex?和Phosome?的成分均與AmBisome?相同。我們分析了所有產(chǎn)品的粒徑分布和藥物濃度，觀察到這兩種產(chǎn)品的平均粒度和PDI分別為100.0/0.118（Phosome?）和95.3/0.089（Amphonex?），均接近AmBisome?（102.0/0.167）（表2）。水合脂質(zhì)體溶液中的Amp B濃度分別為3.41 mg/mL和3.82 mg/mL，兩種產(chǎn)品的標(biāo)簽濃度均與AmBisome?相同，為4mg/mL。雖然Amp B脂質(zhì)體制劑之間存在一些可測(cè)量的差異，但由于可用性有限，每種產(chǎn)品僅分析一個(gè)小瓶或一個(gè)批次。使用USP-4 IVR分析從AmBisome?、Phosome?和Amphonex?中釋放Amp B，表明這些產(chǎn)品之間存在相似性，兩種仿制藥均與AmBisome?相似，f2值大于50，但是，與AmBisome?相比，兩種仿制藥的藥物釋放都略慢（見圖8）。計(jì)算得出的f2值顯示，Amphonex?與AmBisome?之間的相似度（f2=66.3）略高于Phosome?與AmBisome?之間的相似度（f2=55.4）。重要的是，這些數(shù)值的統(tǒng)計(jì)能力有限，因?yàn)槊總€(gè)產(chǎn)品僅分析一個(gè)批次，了解批次間差異對(duì)于評(píng)估仿制藥與創(chuàng)新藥的相似性至關(guān)重要。此外，要證明USP-4 IVR檢測(cè)能夠區(qū)分AmBisome?和由印度監(jiān)管機(jī)構(gòu)從市場(chǎng)上撤出的仿制藥Amp B脂質(zhì)體制劑（如Anfgen?（Genpharma）或Lambin?（Sun Pharmaceutical Industries）），這將具有巨大價(jià)值。 然而，我們未能獲得這些樣品，僅表明IVR分析可區(qū)分通過高壓均質(zhì)法制備的AmBisome?和速釋Amp B脂質(zhì)體。總之，USP-4 IVR分析是評(píng)估AmBisome?與仿制藥Amp B的相似性和差異性的有用工具。
圖8. Sotax?上不同仿制產(chǎn)品在55℃下的累積釋放，溶媒中加入5% γ-CD，所有實(shí)驗(yàn)的總Amp B濃度均為10μg/mL。
雖然已建立的IVR測(cè)定法可以作為Amp B脂質(zhì)體制劑的質(zhì)量控制測(cè)試的有用工具，但該試驗(yàn)不能模擬體內(nèi)藥物釋放，此外，我們不能聲稱IVR試驗(yàn)中更快速的藥物釋放與體內(nèi)更快速的藥物釋放和產(chǎn)品更高的毒性相關(guān)，尚未確定IVR中產(chǎn)品性能與體內(nèi)藥物釋放之間的體外-體內(nèi)相關(guān)性(IVIVC)。這在設(shè)計(jì)在體外具有不同藥物釋放速率的Q1/Q2Amp B相同脂質(zhì)體制劑或獲得具有略微不同藥物釋放特性的商業(yè)制劑將非常有用。通過驗(yàn)證這些制劑的藥代動(dòng)力學(xué)并將體內(nèi)性能與體外藥物釋放相關(guān)，可以建立IVIVC。我們將嘗試在后續(xù)研究中建立IVIVC，等待速釋和緩釋制劑的采購，并從這些制劑中獲得可靠的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。
建立了用于評(píng)價(jià)Amp B脂質(zhì)體制劑的USP-4溶出儀IVR試驗(yàn)。IVR檢測(cè)條件(溫度55°C，釋放介質(zhì)中γ-CD受體濃度為5% w/v)與生理?xiàng)l件相差較遠(yuǎn)，在不破壞脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的前提下，優(yōu)化了IVR檢測(cè)條件以促進(jìn)24 h內(nèi)的藥物釋放，加速了藥物釋放，放大了制劑間Amp B初始釋放差異。該IVR試驗(yàn)成功地用于區(qū)分AmBisome?脂質(zhì)體和含有脫氧膽酸鈉的Amp B膠束制劑（如Fungizone?和Fungcosome）。IVR分析能夠區(qū)分內(nèi)部使用不同方法制備的AmBisome?和Amp B脂質(zhì)體制劑。對(duì)兩種不同的Amp B脂質(zhì)體和AmBisome?的藥物釋放曲線之間的相對(duì)一致性進(jìn)行了評(píng)估，但在對(duì)這些印度仿制藥的質(zhì)量做出結(jié)論之前，需要對(duì)其他批次進(jìn)行分析。總之，我們開發(fā)了USP-4 IVR測(cè)定法，可用于仿制藥行業(yè)快速檢測(cè)AmBisome?和類似Amp B脂質(zhì)體制劑的藥物釋放情況。此外，IVR檢測(cè)開發(fā)過程中應(yīng)用的原理可供其他人應(yīng)用，以便為其他復(fù)雜產(chǎn)品（如脂質(zhì)體、納米顆粒、微球、凝膠或混懸液）建立基于USP-4的IVR檢測(cè)。
